1,第四章,酶学分析技术,2,酶（enzyme）的本质：,高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性,酶的应用：,由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂,酶的特点：,酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临 床诊断和疗效判断,3,主要内容：,酶活性测定的基本知识 酶活性单位的计算与校准 酶活性的测定 代谢物的酶法检测 同工酶测定,4,掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素 了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用教学要求：,5,第一节 酶活性测定的基本知识,酶测定,绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法,,,E,E,6,简介内容：,一、酶活性 二、酶活性单位与酶活性浓度 三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学,7,一、酶活性,定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量表示方法：,,或,,式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
8,二、酶活性单位与酶活性浓度,（一）酶活性单位,定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量表示方法：,惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 国际单位IU（µmol/min） Katal单位（mol/s）,9,1．惯用单位：,20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位,ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）,特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4μmol NADH为一个卡门氏单位,举例：,金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚10,,2.国际单位IU（µmol/min）,定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/minIFCC,2001年 37℃,3．Katal单位,定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。
1Katal＝1mol/sIU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal,11,（二）酶活性浓度,酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位国际单位用IU/L或U/L表示酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.,12,三、酶促反应进程,以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）,13,（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）,特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟,,t1 t2 时间t 图5-1 酶促反应进程曲线,吸光度A,,,,,,线性期,非线性期,R1,R2,延滞期,,,孵育期,延滞期,,14,（二）线性期,此阶段酶促反应速率基本保持恒定； 对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比 ；,此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率 酶活性浓度越高，线性期就越短,线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度 。
线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％ 线性度值越小则线性越好一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性,特点：可代表酶促反应速度,,15,,（三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）,进入非线性期的原因：,反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降特点：,若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 成正比，为一级反应16,四、酶促反应动力学,研究内容：,研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学,指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性 或代谢物浓度研究意义:,17,（一）酶促反应,酶促反应式,米氏方程：,,K4,18,（二）Km的含义与意义,1．Km的含义:,当Km=[S]时， ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax 一半时的底物浓度2．Km的意义,Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 反映酶对底物亲和力的大小 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应 计算工具酶的用量,19,（三）Vmax的含义,定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。
应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 计算公式为：,,(单位是s-1),计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）,20,（四）Km和Vmax的测定,1、双倒数作图法：,纵轴截距为,斜率为,横轴截距为,,Linweaver-Burk作图法,21,利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质：,如竞争性抑制：,22,第二节 酶活性单位的计算与校准,一、酶活性单位的计算（掌握） 二、酶活性单位的校准（了解）,内容简介：,23,一、酶活性单位的计算,（一）通用公式,,前提条件：必须保证启始底物量充足（[S]》Km），使酶促反应处于零级反应期即线性期，反应初速率等于最大反应速率，从而使酶发挥最大活性——mu与酶活性正相关，而与启始底物量无关,24,,注释：式中U：酶活性单位数，m0：规定的产物生成量或底物消耗量，V0：规定的样本体积，t0：规定的反应时间，mu：实际产物生成量或底物消耗量，Vu：实际样本体积，tu：实际反应时间,实测的酶活性大小,规定的酶活性单位,(5. 1),25,（二）采用酶活性惯用单位的计算公式,常用设立标准管（校准管）的对比法（简称对比法、比较法） 测量吸光度的变化求出。
特点：校准管并不含酶 常用定时法（固定时间法）求ΔA, ΔA=A终止点-A空白 也可用不设校准管的比尔定律摩尔吸光系数法求出,mu的确定方法：,26,惯用单位的计算公式：,测定产物生成类的计算公式,测定底物消耗类的计算公式,,根据测 定对象,27,1、测定产物生成类的计算公式,mu为生成的产物量，反应后从无到有，其存在量即生成量，与酶活性成正比,常规计算方法和公式： 设立一个校准管，与测定管同步操作特点：,,·Cc=Cu,△Au：测定管吸光度，△Ac：校准管吸光度，Cc：校准物摩尔浓度， Vc：校准物体积,,Mu=Cu×Vc,（5.2）,28,校准曲线法和公式：,,设立多个校准管制备△A-U校准曲线，测出△A值后查出U值,,其中，k1和△Ac都是变量，随不同的Vc而呈比例变化上相当于直线方程Y = bX 图5-3纵坐标上某一点△Au(=△Ac)相对应的横坐标U值为k1各校准管所相当的酶活性单位数k1可由其不同的Vc代入公式算出 ）,,(5.3),29,测定管：血清0.1ml加底物液等后于37℃水浴15min，再加显色液显色同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管（在反应最后加血清），510nm处以空白管调零测出△Au。
校准管：以校准曲线中第2管为例取0.05mg/ml的酚校准液0.4ml，加显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚校准液、其它步骤相同的空白管调零，510nm处测出△Ac 【计算】 由式5.2有：,可见，第2管相当于酶活性单位为：20金氏单位/100ml血清，常简写为20金氏单位单位定义】1金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚操作】,例: 金氏法测定血清ALP30,2．测定底物消耗类的计算公式,mu为消耗的底物量，反应后从多到少 在测定底物消耗类时，将不加样本不加底物而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为空白管； 将不加样本而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为“对比”校准管（校准管）空白管不含有底物对比”校准管与测定管反应前底物量相同特点：,单一校准管即“对比”校准管时的测定：因产物生成量与底物消耗量 相等，将式5.2中代表产物生成量的△Au换成代表底物消耗量的△Ac-△Au 后有：,,计算方法和公式：,（5.4）,31,例：碘色法测定血清淀粉酶（AMS）,【单位定义】 1惯用单位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉。
操作】 测定管：稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37℃水浴7.5min后显色 校准管(“对比”校准管)：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同 反应完成后，660nm处以蒸馏水调零，分别测出△Au、△Ac 【计算】由式5.4有：,32,（三）采用酶活性国际单位的计算公式,1．用微摩尔吸光系数（µε）表示的国际单位计算公式,摩尔吸光系数ε是表示吸光度与摩尔浓度（mol/L）、光 径（cm）之间关系的一个法定计量单位.,摩尔吸光系数 微摩尔吸光系数 毫摩尔吸光系数,33,在连续监测法测定酶活性时，tu为酶促反应曲线线性期内时间变化值（亦可表示为△tu ），△Au为线性期内测定管吸光度变化值,,,上式中ε：摩尔吸光系数，Cu：样本摩尔浓度（原始浓度），l：比色杯光径注意Cu/nu为比色杯中的样本摩尔浓度（比色浓度）根据酶活性国际单位的定义：m0=1µmol，t0=1min常取规定样本体积V0=1L 相应地，tu计量单位为min，ε变为µε的L·µmol-1·cm-1，l为cm，则用微摩尔吸光系数（µε）表示的国际单位计算公式由上式可简化为：,,(5.5),34,另外一种推导方式,,将比尔定律△Au =εCul/nu两边同时除以tu，结合样本稀释倍数展开后得到,35,0.2ml样本中加入底物液于37℃15min，终止反应后总体积为 5.2ml。
405nm处以空白管调零，1cm比色杯中测△Au已知对硝 基酚在该条件下的ε为18 380 L·mol-1·cm-1例: 对硝基酚比色法测β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）计算】由式5.7有,36,2．用毫摩尔吸光系数（mε）、摩尔吸光系数（ε） 表示的国际单位计算公式,在吸光系数的数值关系上，以340nm处NADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核 苷酸，还原型辅酶Ⅰ）在一定条件下的吸光系数为例： ε= 6.22×103 L·mol-1·cm-1 mε = 6.22 L·mmol-1·cm-1 µε= 6.22×10-3 L·µmol-1·cm-1 可见，mε值 = 103µε值，ε值=106µε值，各代入式5.5后有：,,（5.6）,（5.7）,（5.8）,37,3．计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化 方向的关系,式5.5、式5.6、式5.7中△Au/tu以外的部分都相等，称为计算因数 Factor值（简称F值，或K值）：,,（5.9）,由式5.9展开后可见，F值的单位是µmol/L不作校准时可采用试剂盒 厂家给定的F值.,38,4．国际单位间无可比性 国际单位数。