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1、信号放大时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用【摘要】 信号放大时间分辨荧光分析技术是一种新型的超微量的标记分析技术。它是以生物信号放大为基础，以镧系元素螯合物为标记物，以时间分辨和波长分辨为测量方法，充分利用了酶标记分析和PCR扩增等分析技术优点的技术。它的独特优点是非同位素和超灵敏度。本综述介绍了TRFA的特点以及酶放大、二次酶放大、铕纳米颗粒、滚动循环放大、免疫PCR和荧光淬灭分析等信号放大时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用。信号放大时间分辨荧光分析技术在生物分析中极其广泛的应用，显示出具有很好的发展前景。【关键词】 信号放大；时间分辨荧光分析；镧系元素螯合物Studies and ap
2、plications of time-resolved fluorescence assay based on signal amplification【Abstract】 Time-resolved fluorescence assies(TRFA) based on signal amplification are new ultrasensitive labelling assay technologies.The basis is biosignal amplification,the labels are lanthanide chelates,and the detection m
3、ethods are the time-resolved and wavelength-resolved fluorescence assay in the technologies.In addition,enzyme-labelled assay and PCR amplification et al are used in the technologies.The several main signal amplification methods and amplifications, for example, enzyme-amplification, two-round enzyme
4、-amplification,europium nanopartical,rolling circle amplification,immuno-PCR and fluorescence quenching assay et al, were introduced in the summary. The unique advantages of nonisotope and ultrasensitivity and extensive applications in bioassay shown good prospects of TRFA based on signal amplificat
5、ion.【Key words】 signal amplification; time-resolved fluorescence assay; lanthanide chelate近些年来，非同位素标记分析技术发展迅速。它主要包括：酶标记分析技术、化学发光分析技术、生物发光分析技术和时间分辨荧光分析技术。信号放大时间分辨荧光分析技术克服了其他技术的缺点，具有非同位素、灵敏度高、标记物制备简单、测量快速和分析动态范围宽等优点，成为一种最有发展前途的非同位素标记分析技术。1 信号放大时间分辨荧光分析技术的原理及特点信号放大时间分辨荧光分析（time-resolved fluorescence as
6、say， TRFA）技术是把生物信号放大、镧系元素螯合物的固有优点以及时间分辨和波长分辨两种测量技术合为一体，极其有效地排除了非特异荧光，测量了特异荧光，因而灵敏度很高。信号放大时间分辨荧光分析技术的优点归根到底是源于镧系元素螯合物的固有特点1。它们是：(1)激发光谱带较宽，可以增加激发能，提高标记物的比活性。(2)发射光谱带很窄，50%发射谱带的宽仅约为10nm，可以利用通带滤光片，只允许峰值波长5nm谱段通过供测量，在如此窄的谱段内，非特异荧光很少，可有效降低本底荧光，且能量损失也不大。(3)激发光与发射光之间的stokes位移大，有利于排除激发光散射等的干扰。(4)镧系离子螯合物的荧光寿
7、命很长，约1ms,在时间分辨荧光仪上测量时，脉冲光源激发后，可适当延迟一段时间，待其他短半衰期（110ns）的非特异荧光完全衰变后再测量，从而极大的降低了本底荧光，实现了时间分辨，灵敏度大大提高。(5)镧系离子由激发态跃迁到基态时发射荧光，在测量时间内可反复激发镧系离子，相当于大大提高了标记比活性。此外，时间分辨荧光分析技术的分析动态范围宽，可达45个数量级；标记物制备简单，稳定性好，有效期长，不受半衰期影响；标记蛋白质时反应条件温和，蛋白质活性受损少；测量快速，易于自动化。2 生物素链霉亲和素系统放大的时间分辨荧光分析1988年，出现了一种新的双功能螯合剂，称为4,7-双（氯磺酰基苯基）-1
8、,10-菲咯啉-2,9-二羧酸4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid,BCPDA，为了增加生物放大又把生物素-亲合素系统（biotin-avidin system,BAS）引入免疫反应系统。本分析系统的基本原理是：固相McAb与抗原反应后，再加入生物素化McAb，形成免疫反应复合物，再加入通用试剂SA-BCPDA-Eu3+，其中SA是链霉亲合素（streptavidin，SA），借助SA与生物素的高特异和高亲合力的结合，把这种通用试剂连接到免疫反应复合物上，最终形成的复合物为：固相McAb-抗原（
9、标准或样品）-（McAb-生物素）-（SA-BCPDA-Eu3+）2。本分析系统的特点是不用增强液，可在固相下直接测荧光。该系统共有三次放大作用，但放大倍数仍然远小于增强液系统，灵敏度可能略低，为此也有学者在最后一步加入增强液，进行液相荧光测定。3 酶放大时间分辨荧光分析酶放大时间分辨荧光分析（enzyme-amplified time-resolved fluorescence assay, EATRFA）系统，它的核心思想是把生物素-链霉亲和素的高亲和力和放大作用、酶放大作用、镧系元素螯合物的特有优点和时间分辨测量技术结合，不用增强液，在液相下测量荧光。其基本原理是：固相McAb与抗原和生
10、物素化McAb同时反应，形成免疫反应复合物；然后再与碱性磷酸酶（ALP）标记SA的复合物ALP-SA反应，形成复合物（固相McAb-抗原-McAb-生物素-SA-ALP）。再加入ALP的底物5-氟水杨酸磷酸酯（5-fluorosalicyl phosphate，5-FSAP），生成产物5-氟水杨酸（5-fluorosalicylic acid，5-FSA）。再加入铽（Tb3+）乙二胺四乙酸（EDTA）螯合物，在高pH下，形成荧光寿命长、荧光产额高的三元复合物FSA- Tb3+-EDTA。测定546nm波长的荧光强度即可得抗原浓度3,4。在本法中，环境改变和淬灭体对荧光发射特征影响极小；镧系元素
11、污染的影响也非常小5；在液相下测荧光，不用分离，非常简捷。4 二次酶放大时间分辨荧光分析近年又提出二次酶放大时间分辨荧光分析系统3,6，用于核酸杂交分析。其原理如下：先用抗体包被微滴定孔，再经特异抗原标记的靶DNA与该抗体反应，将靶DNA连接到固相抗体上。然后用生物素化探针与靶DNA杂交，再通过生物素与链霉亲和素的反应，将链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（HRP）连接到杂化物上。当加入含有H2O2和生物素化酪胺（B-T）的HRP的底物溶液，因有H2O2存在，HRP在催化酪胺氧化，产生游离基团的同时，也催化事先固定在微滴定孔表面的蛋白质（如白蛋白）的酪胺酰基的氧化。由于二聚体形成反应，于是B-T就
12、共价地结合到固相上。再加入ALP-SA，经B与SA的反应，ALP结合到固相上。至此，实现了杂交和建立了杂交的定量关系。洗涤后，加入ALP的底物5-FSAP，此后的步骤与EATRF分析系统的相同。二次酶放大时间分辨荧光分析系统的主要目的是增加放大倍数，大大提高分析灵敏度。有报告称此系统的特异信号可增加30倍，信/噪比可改进10倍，灵敏度可达310-16mol7。荧光光谱明确可靠。测量荧光强度时，溶液中有5-FSA：EDTA：Tb三元复合物，它的最大吸收波长与仪器的激发波长337nm几乎相等，很匹配，它的四条发射谱带中547nm谱带的强度最强，用（5475）nm的窄通带滤光片，只允许其通过，是供测
13、量的荧光信号。5-FSAP本身不发荧光，也不能与Tb-EDTA结合成复合物。游离的5-FSA只发射420nm波长的荧光，也被滤光片滤掉。EATRFA系统的优点是：灵敏度非常高，对PBR322DNA的杂交分析，国外Evanglista等报道为3pg8，国内赵启仁等报道为10pg3，而二次EATRFA系统的灵敏度更高；分析系统简单，全过程操作，可以一管到底，在检测荧光强度时，不需要分离，可直接在液相下测量；分析快速，测定全过程只需要十几小时，且主要是温育需要过夜；相关试剂的有效期长；不存在放射性对人体的危害等问题；不存在金属离子污染问题；环境改变和淬灭体对荧光特征发射的影响极小；有利于分析自动化实
14、现。5 纳米颗粒的应用近几年来，纳米颗粒应用到时间分辨荧光分析技术中。每个纳米颗粒含有数千镧系元素螯合物，这样可以大大提高标记比活性。在均相时间分辨荧光分析中，使用纳米颗粒技术，当激发光激发时，大量增加的镧系元素螯合物作为能量供体将能量传递给能量受体，传递的能量增加，受体所受的激发荧光强度也大大增加。Harma等和Kokko等分别报告了用铕纳米颗粒和时间分辨荧光免疫分析技术进行了超灵敏的前列腺特异抗原（PSA）和雌二醇的测定9，10。6 滚动循环放大时间分辨荧光分析由于ELISA等酶免疫分析的灵敏度和特异性受限，特别是当分析材料或抗原的量很少时，2000年，Schweitzer等11利用滚动循
15、环放大（rolling circle amplification, RCA）进行了超灵敏的抗原测定。滚动循环放大用于蛋白抗原类的测定，被称为“immunoRCA”。它是一个多元化的分析系统，可以一次检测多种抗原，可用于免疫诊断和基因诊断。“immunoRCA”的原理是：将抗原（标准或待测样品）包被在固相上，加入共价连接寡核苷酸引物的抗体。通过抗原和抗体的特异结合，寡核苷酸引物连于固相。这样，在环状DNA、DNA聚合酶和核苷酸的存在下，进行扩增。扩增的结果就是一条很长的DNA分子，它包含了数百个拷贝的环状DNA序列12。这时，我们用生物素化的探针和其杂交，利用生物素-链霉亲和素系统对扩增产物DN
16、A的量进行时间分辨荧光测定。因为在一定范围内，所得扩增DNA的量正比于固相的量，所以可以定量固相抗原。“immunoRCA”具有灵敏度高，特异性强；测定快速，动态范围宽；不需要特殊的设备，操作更简便；避免假阳性结果；检测结果更准确等优点13,14。“immunoRCA”不仅可用于蛋白抗原类的测定，其基本原理还可应用于点突变检测以及直接检测病毒DNA或RNA来诊断病毒感染。2003年，Wang B等用RCA高效地测定了SARS-CoV病毒DNA15。2005年，Silander K等用少量DNA经过多样引物进行了SNP基因扩增的评估16。7 免疫PCR时间分辨荧光分析很多疾病的生命和分子基础的基本原理的阐明，需要研究生物分子的相互作用，甚至是在单个细胞或单个分子水平上
