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1、,刘丝丝 2017年8月25日,钙成像实验操作及数据处理,钙成像实验操作,1.钙成像原理,基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应,钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质,2. 实验操作,操作步骤： （1）Fluo-4工作液配制： 每管Fluo-4 AM：+8lDMSO +2lF-127 （2）Fluo-4工作液使用： 储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1lFluo-4工作液,主要试剂及仪器： Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜,2. 实验操作,（3）Flu
2、o-4指示剂孵育： 将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000lFluo-4溶液，37孵育20min。 （4）清洗： 将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最后加上相应的浴液开始拍摄。 （5）钙离子成像： 使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。 以Leica SP5的CLSM为例： 激发光：488nm 采用xyt时间轴拍摄模式：Time interval：3s；Frames：200（根据实验而定）。,钙成像数据处理,必备软件,Image J,MATLAB,Origin,Photoshop,Adobe Illustrator,1.图片处理
3、，采集数据,soft,stiff,stiff,stiff,soft,soft,1.1.新建件夹X，将待分析的组图件（200张）考件夹X中 1.2.导图：打开Image J 后， File - Import - Image sequence（会弹出新框Sequence Options , 点OK） 1.3.变换颜色： Image - Lookup Tables - 16_colors（注意：如果是彩色的先转成灰度图） 1.4.调对度： Image - Adjust - Brightness /Contrast（会弹出新框B&C,将图调节到最佳） -Apply（会弹出新框Apply LUT to
4、all 200image numbers slices in the stack? Choose YES）,1.图片处理，采集数据,soft,stiff,stiff,stiff,soft,soft,1.5.选细胞： Analyze - Tools - ROI Manager（会弹出新框ROI Manager） - 把Show all and Labels 前打钩 - 主菜单栏选择选择不同形状具圈细胞（PS.先选择背景，再选择细胞） - 每圈个细胞后点Add - 圈完所有细胞后截屏保存图（PS.保存了标记细胞个数和顺序）新建件夹X中 1.6.数据导出： ROI Manager - More -
5、Multi Measure （会弹出新框Multi Measure）- 将Measure All 200image numbers Slices打钩 - OK - Results（会弹出新框Results） -File - Save as（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls新建件夹X中）,1.图片处理，采集数据,soft,stiff,stiff,soft,soft,1.7.在件夹X中，新建个Excel件，将数据粘贴新的Excel中命名为Results1.xls，只保留编号、 Mean、 Slice三列，将Area列删除 1.8.Close the program
6、 Image J,在Analyze里面的Set Measurements可以设置Mean值,2.Matlab数据处理,soft,stiff,stiff,soft,soft,2.0. start the program Matlab 2.1.复制程序：将程序件CalciumFlow20101105.m拷新建件夹X中，此时件夹X中应包括：原始图件夹、截屏图、 Results.xls、 Results1.xls、 CalciumFlow20101105.m 2.2.导件夹X：打开Matlab后，点右上按钮， 会弹出新框浏览件夹，选中需导的件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现Current
7、Folder，列出了件夹X中所有件 2.3.双击打开件夹X中新建的Excel件Results1.xls（切勿打开原Excel件），程序上会弹出Results1.xls中的数据，点按钮Import - Import Data,2.Matlab数据处理,soft,stiff,stiff,soft,soft,2.4.修改程序：双击左侧打开件夹X中CalciumFlow20101105.m，弹出程序语，根据每次图具体情况修改程序，包括修改三条路径（foutin=fopen、 fin=fopen、 fout=fopen），所圈细胞个数（nreg=），总图数（np=），基线base line（nnp=20
8、，15,10,5）的图数，以及拍摄时间间隔（tstep=） 2.5.运程序：点击运按钮 -如若运成功，左侧件夹X中会出现in.txt和out.txt件，则表明运成功，否侧会出现运错误提醒 2.6.Close the program Matlab,3.Origin数据作图,soft,stiff,stiff,soft,soft,3.0start the program Origins 3.1.打开OriginPro 8.5后， File - Import - Single ASCII -弹出新框导件夹X中out.txt件，弹出Book 3.2.点击Book的左上全选后，右击， Plot - Line Line，弹出Graph1，保存 3.3.Close the program Origins,4.文章作图,soft,stiff,stiff,soft,soft,Thanks for your attention!,
