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1、ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2004 年 5 月 15 日;12(5):1210-1213 高效液相色谱法测定人胃黏膜中 -氨基丁酸和谷氨酸含量朱人敏, 秦苏堤, 何小平, 汪芳裕, 李 宁, 刘福坤 朱人敏, 秦苏堤, 何小平, 汪芳裕, 南京军区南京总医院消化内科江苏省南京市 210002李宁, 刘福坤, 南京军区南京总医院普通外科 江苏省南京市 210002项目负责人: 朱人敏 , 210002, 江苏省南京市中山东路 305 号, 南京军区南京总医院消化内科. 电话: 025-80861126收稿日期: 2003-11-13 接受日期 :
2、2004-02-01摘要 目的: 建立一种可同时测定胃黏膜组织微量 -氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的高效液相色谱法.方法: 用异硫氰酸苯酯 (PITC)作衍生剂，色谱柱为 Pico/Tag 氨基酸专用柱，梯度洗脱，紫外检测波长 254 nm.结果: GABA 在 0.125-6.25 nmoL/mL 范围，Glu 在 0.025-2.5 mol/mL 范围，线性关系良好; GABA 和 Glu 加样回收率分别为90.4-104%，88.1-105.5%; 批内误差分别为 3.56%，和 1.12%; 批间误差分别 7.47%和 5.98%.结论: 本法稳定、灵敏，可用于胃黏膜组织
3、 GABA 和 Glu 含量的检测 .朱人敏, 秦苏堤, 何小平, 汪芳裕, 李宁, 刘福坤. 高效液相色谱法测定人胃黏膜中 -氨基丁酸和谷氨酸含量. 世界华人消化杂志 2004;12(5):1210-1213http:/ 引言-氨基丁酸(-aminobutyric acid，GABA) 主要来源于三羧酸循环中的谷氨酸 (Glu)，是一种重要的抑制性神经递质，广泛存在于脊椎动物脑内，外周组织中含量很低 1-3. 近年来研究表明: GABA 除了作为胃肠神经递质，还有可能作为一种胃肠激素 4，协同 Glu，参与胃肠黏膜细胞分裂、分化、成熟的调节 5，抑制胃癌的发生 4. 随着 GABA、Glu
4、与胃癌关系研究的不断深入，要求建立一种快速、精确定量胃黏膜组织 GABA、Glu 含量的方法.国外已有文献报道，应用荧光分光光度法测定人胃黏膜组织 GABA 含量，但灵敏度较低，干扰因素较多 5. 本文首次采用异硫氰酸苯酯(PITC) 柱前衍生，高效液相色谱(HPLC)-紫外检测法测定胃黏膜组织 GABA 、Glu 含量. 国内外未见此类报道. 该法的优点是 PITC 与氨基酸反应生成能在 254 nm 下检测的 PITC-氨基酸 6-11，分析速度快，灵敏度高，结果令人满意.1 材料和方法1.1 材料 Waters 高效液相色谱仪系统(美国 Waters 公司)，其中包括 510 泵两台，4
5、86 紫外检测器，自动梯度控制器，控温仪及柱温箱; Pico/TagTM 工作台; 7 725 i 进样阀(美国 Rheodyne 公司); 色谱工作站(杭州英谱公司). -氨基丁酸和谷氨酸: 美国 Sigma 公司; 衍生剂异硫氰酸苯酯 (PITC): 美国 Pierce 公司; 乙腈、甲醇均为色谱纯: 德国 Merck 公司; 乙酸钠为分析纯: 英国普尔 BDH 化学公司; 其余试剂均为市售分析纯试剂，水为重蒸馏水.1.2 方法1.2.1 色谱条件 色谱条件 色谱柱 : Pico/Tag 氨基酸专用柱 3.9 mm 300 mm; 流动相: 流动相 A 为乙腈:70 mmoL/L-1 醋酸
6、缓冲液(pH 6.5) =25:975，含 0.25 mL/L-1 的 10 mmoL/L-1 EDTA; 流动相 B 为乙腈:水:甲醇=450:400:150.梯度洗脱条件如表 1. 紫外检测波长 254 nm; 柱温 45 C; 进样量 20 L.表 1 梯度洗脱程序表时间(min) 流动相 (mL/min-1) A% B% 曲线起始 1.00 100 0 -13.50 1.00 97 3 1120.00 1.00 96 4 820.50 1.00 20 80 522.50 1.00 0 100 623.00 1.00 100 0 630.00 1.00 100 0 61.2.2 溶液配制
7、 样品稀释液 : 5 moL/L-1 的 Na2HPO4 缓冲溶液，pH 7.4. 样品干燥液: 甲醇:1.0 moL/L-1 醋酸钠:三乙胺 = 2/2/1(v/v/v). 衍生化试剂: 异硫氰酸苯酯(PITC):甲醇:乙醇 :三乙胺:水= 1/6/1/1/1 (v/v/v/v/v); 需新鲜配制.1.2.3 标本收集及样品前处理 于手术当天取胃癌组织标本(约 100 mg)，同时取距癌组织边缘 5 cm 以上的胃黏膜组织作为对照，并经病理证实为癌组织和正常组织，迅速放入液氮中冷冻， 再转移至-70 C 冰箱保存至测定. 测定时，称取 100 mg 左右的胃黏膜组织置小研钵中，倒入液氮，待组
8、织冷却坚硬后进行研磨，粉碎后再加入液氮研磨，如此反复 3 次，使组织完全粉碎.加入 400 L 的样品稀释液将粉碎的组织完全转移到离心管中，1 000 r/min，4 C 离心 5 min，上清液转移到超滤管中，1 000 r/min ，4 C 离心 30 min.1.2.4 样品衍生化 取超滤液 20 L 注入 0.5 cm5 cm 的玻璃试管中，冷冻干燥，然后加入干燥液 10 L，再一次冻干，再加入 20 L 衍生化试剂，室温衍生 20 min 后经冻干置冰箱 4 C 保存. 50 L 样品稀释液复溶，10 L 或 20 L 进样.2 结果2.1 色谱行为 图 1 为 Glu 与 GABA
9、 标准色谱图，各自的保留时间分别为 Glu =3.98 min，GABA =16.7 min. 图 2 为样品色谱图，从色谱图可知，该方法能很好的分离 Glu 与 GABA.图 1(PDF) 标准品色谱图.图 2(PDF) 样品色谱图. 2.2 标准曲线 分别精密配制 Glu 和 GABA 标准溶液，使其含量为 Glu: 0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1 ，2.5 moL/mL -1; GABA: 0.125，0.25，0.625，1.25，2.5 ，6.25 nmol/mL -1. 按照样品衍生步骤衍生并 HPLC 测定，以峰面积对质量浓度作线性回归，其线性方程为: Glu
10、 Y=1.58106 C+18027，相关系数 0.9 998; 最小检测浓度 2.5 nmoL/mL-1. GABA Y=3 723.3C-547.8，相关系数 0.9 988; 最小检测浓度 0.01 nmol/mL-1.2.3 回收率 在混合样品超滤液中加入 Glu 和 GABA 标准溶液，用加样回收方法考察方法的准确度. -氨基丁酸和谷氨酸加样回收率分别为 95.4%，93.5%(表 2).表 2 方法回收率(meanSD)样品测定值 加入量 测定值 回收率(%)GABA 0.3180.013 0.5 0.8520.014 106.83.0(nmol/mL-1) 0.75 1.0570
11、.082 95.35.3Glu 0.3100.005 0.5 0.8370.049 105.513.1(mol/mL-1)1 1.2340.036 92.54.42.4 精密度 同时取某一样品超滤液三份，按衍生化法处理测定，GABA 和 Glu 的批内误差分别为 3.56%，1.12%.不同日取样三次，如上处理求得 GABA 和 Glu 的批间误差分别 7.47%，5.98%.2.5 临床应用 用该法测定了 30 例胃癌手术患者癌组织和正常组织的 GABA 和 Glu 含量，胃癌组织 GABA 和 Glu 含量显著高于正常组织( P 0.05，表 3). 这一现象值得引起临床重视，可以为胃癌的
12、临床诊断和治疗提供参考 .表 3 胃癌组织与正常胃黏膜组织 GABA 和 Glu 含量(meanSD, n =30)氨基酸 癌组织 正常组织 t PGABA(nmol/g-1) 0.8320.576 0.3620.417 3.29 0.05G l u (mol/g-1) 1.3240.596 0.9070.342 2.90 0.05 3 讨论GABA、 Glu 在胃黏膜组织含量极低，不具有紫外吸收，也不发射荧光，因此需将他们转变为能被检测的高灵敏度衍生化产物6-11. 本文用 PITC 作衍生剂与胃黏膜组织中的氨基酸反应，衍生物经 HPLC 分离后紫外检测，建立了一种更简便、更灵敏的方法，适于
13、检测胃黏膜组织的微量 GABA、 Glu.本法的优点: (1)组织样品处理时，采用液氮冷冻碾磨法碾碎胃黏膜组织，该法比电动匀浆或超声匀浆法使组织粉碎更加完全，而且简单易行; 易于推广. (2)组织衍生前，采用超滤法去除蛋白，不但去除完全，回收率高，样品也没有被稀释，对于含量极低的氨基酸分析是一个非常有效的手段，但美中不足的是成本较高，需要超速冷冻离心机. (3)组织衍生时，采用PITC 作为氨基酸衍生剂，具有稳定，不会产生水解反应，也不会形成多级衍生物的优点 6-11，但有时过量试剂会产生干扰.本法除了采用在衍生化后真空干燥除去过量试剂外，还通过调节流动相梯度，使试剂峰与样品峰分离完全.(4)
14、色谱分析时，采用Pico/Tag 氨基酸专用柱，他是 Waters 公司的专利产品，可非常好的分离 PTC-氨基酸，可同时分析 18 种常用氨基酸，但有报道柱寿命短，最多能分析 150 个 PITC 样品. 在我们实际工作中采用前处理干燥完全，乙腈冲洗再生方法，实际分析样品可达到约 500 个. (5)实际操作时，采用 40.00.5 C 柱温，提高柱温能缩短保留时间，降低柱压，但过高的柱温会减少分离度，使 -氨基丁酸与在其后出现的瓜氨酸以及衍生剂峰重合，因此使柱温保持在 40.00.5 C 为最佳. 生物样品中微量氨基酸的测定在医学领域中占重要地位，经典的氨基酸分离方法是离子交换色谱法，此法
15、需特殊装置，且分析时间较长，而荧光分光光度法和氨基酸自动分析仪检测，灵敏度较低，干扰因素较多 .测定 GABA 和 Glu 的高效液相色谱方法，多为用邻苯二甲醛在催化剂作用下与氨基酸发生衍生化反应，衍生物经 HPLC 分离，电化学检测或荧光检测器检测，并且分析对象为含量较高的脑组织和血清 12-15. 本文采用 PITC 为柱前衍生剂，配合紫外检测仪，建立了一种高效、稳定、简便、快捷的 HPLC 梯度洗脱方法 .该法条件简便、灵敏度高，分离周期短，适于检测胃黏膜组织中微量的 GABA、 Glu，应用前景广泛.4 参考文献1 Hinoi E, Takarada T, Ueshima T, Tsuchihashi Y, Yoneda Y. Glutamate signaling in peripheral tissues. Eur J Biochem 2004;271:1-132 Watanabe M, Maemura K, Kanbara K, Tamayama T, Hayasaki H. GABA and GABA receptors in the central nervous systemand other organs. Int Rev Cytol 2002;213:1-473 Kuroda E, Watanabe M
