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1、基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘 要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的
2、操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。（一） 实验过程1. 实验部分流程： 片段胶的回收小麦幼苗小麦总RNA的提取RT-PCR扩增小麦GAPDH基因pGEX-4T-1质粒提取表达载体的构建表达菌株转化目的蛋白诱导表达目的蛋白Western 杂交检测 2小麦总RNA提取（Trizol法）2.1 材料小麦幼苗2.2 试剂配制及
3、器具处理 0.1的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1的DEPC H2O中浸泡过夜（37），高压灭菌，80烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160烘烤6h以上。无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（1802h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。Trizol 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。氯仿(最好用新的)。异丙醇(最好用新的)。2.3 操作步
4、骤：先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。室温放置5min，然后加入200L的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500L异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4下12000rpm离心5min。重复步骤。弃去上清液
5、（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥510min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30L DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可5560水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。3. RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 试剂 RNA模板Olig（dT）18反转录缓冲液dNTP M-MULV反转录酶 RNA抑制剂（RNasin）Premix EX Taq DNA聚合酶 PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1 RNA的反转录采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA
6、 Synthesis KitTotal RNA 6L（需加入RNA约1g）OligodT primer1LH2O（nuclease-free）5L12L65 5min，补加下列试剂：5 Reaction buffer4LRibolockRNase Inhibitor1L10mM dNTP Mix2LRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase1L20L42 60min70，5min，20保存3.2. 2 PCR扩增目的基因用表达引物扩增目的基因（25L体系）2PCR Mix12.5L95 1min35cycles95 10s58 20s72 45s72 10mi
7、n16cDNA1L引物GA22PDH1-11L引物GAPDH1-21LH2O9.5Ltotal25L PCR产物经胶回收。4核酸琼脂糖电泳分析4.1 试剂 TAE缓冲液（50）：用时需稀释50倍 点样缓冲液Loading buffer（10）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶，注意EB具致癌作用。 琼脂糖4.2 操作步骤4.2.1 琼脂糖凝胶的制备称1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中加热熔化。4.2.2 胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE缓冲液），拔掉梳子。注意
8、：缓冲液要高出胶面2mm。4.2.3 点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer（10），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。4.2.4 电泳接通电源，80V电压电泳40min左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2处时停止电泳。4.2.5 观察及照相将凝胶取出，在EB溶液中浸泡10min后，用凝胶成像系统照相。5.pGEX 4T-1质粒的提取5.1 实验材料 含质粒的大肠杆菌 5.2 试剂 质粒提取试剂盒(天根生物科技)村民建房委员会应建立村级农房建设质量安全监督制度和巡查制度，选聘有责任心和具有一定施工技术常识的村民作为义务巡查监督员，开展经常性的巡查和督查。5.3 操作步骤
9、5.3.1 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上，37培养 24 h，然后从平板上挑取单菌落，接种于 5 mL 液体培养基中，37培养 12 h。 5.3.2 提取步骤 柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500L 的平衡液 BL， 12,000rpm（13,400g）离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（13,400 g）离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 向留有
10、菌体沉淀的离心管中加入 250L 溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 向离心管中加入 250L 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。 向离心管中加入 350L 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出 现白色絮状沉淀。12,000rpm（13,400g）离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（13,400g）离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱 CP3 放入收
11、集管中。 向吸附柱 CP3 中加入 600L 漂洗液 PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（13,400g）离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。 重复操作步骤 7。 将吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm（13,400g）离心 2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100L 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000rpm（13,400g）离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。 5.3.3 琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA 6
12、表达载体和目的片段的酶切6.1 试剂 BamH Sal BamH buffer 质粒提取试剂盒 6.2 操作步骤 6.2.1 在 LB 液体培养基中接入带pGEX 4T-1 质粒的菌种，在 37下 200rpm 摇菌过夜。参见实验 8 的方法提取质粒。 6.2.2 质粒 DNA 和目的片段的酶切 管号pGEX 4T-132LPCR 产物32LddH2O10L10LBamHBuffer（10）5L5LBamH1L1LSal2L2L7 载体和外源 DNA 的连接反应 7.1 试剂 目标 DNA 片段（PCR 扩增产物） 载体（pGEX 4T-1 酶切回收产物） 10ligation 缓冲液 T4
13、DNA 连接酶 ddH2O 7.2 操作步骤 取一个 200L 的 EP 管依次加入下列试剂： 2buffer：5 LpGEX 4T-1 酶切回收产物：1 LPfu扩增并酶切回收的片段：3 LT4 连接酶：1 L离心30Sec，使反应体系充分混合，1622连接 34h。8 感受态细胞的制备及转化8.1 实验材料 大肠杆菌 Top 10 或 BL21（DE3）PlysS8.2 试剂 LB 培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录 2） 氨苄青霉素 8.3 操作步骤 8.3.1 感受态的制备 从 LB 平板上挑取单克隆于 5ml LB 培养基中，37 200rpm 摇菌 1216h。 将活化过的菌
14、按 15的体积比接种到新的 LB 液体培养基中，37 200rpm 摇菌约 2h，OD 600 约为 0.4。 取 1.5ml 摇好的菌液于一个1.5ml 的 EP 管中，4 4000rpm 离心 3min，弃上清。 加 250L 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4 6000rpm 离心 1min 弃上清。 加 200L 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于 4 存放。12h 内使用效果最佳。 注意：无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。 8.3.2 转化 将盛有感受态细胞的 EP 管放置于冰上 10min，加入 1
