微生物发酵法生产 L-色氨酸的研究摘要:L-色氨酸是人体和动物体生命活动必需的 8 种氨基酸之一,在人体内不能自然合成,必需从食物中摄取它以游离态或结合态存在于生物体中,对动物的生长发育、新陈代谢等生理活动起着非常重要的作用,被称为第二必需氨基酸,在食品、饲料和医疗等诸多行业应用广泛L-色氨酸的生产方法有化学合成法、转化法和微生物发酵法近年来,随着代谢工程在色氨酸菌种选育中的成功运用,微生物发酵法逐渐成为主要的色氨酸生产方法系统综述了微生物发酵法生产色氨酸所涉及的代谢工程策略,包括生物合成色氨酸的代谢调控机制以及途径改造的措施和效果,此外,还探讨了 L-色氨酸未来的发展前景关键词:L-色氨酸;代谢工程;微生物发酵法1 L-色氨酸的理化性质 〔1~3〕L-色氨酸学名为 B-吲哚基丙氨酸,英文名 L-Tryptophan,化学名 L-B-(3-吲哚基)-A-丙氨酸,别名 L-胰化蛋白氨基酸,化学式 C11H12O2N2,相对分子量204.23L-色氨酸属于中性芳香族氨基酸,呈白色或微黄色结晶或结晶粉末,无臭,味微苦L-色氨酸在水中微溶,在乙醇中极微溶解,在氯仿中不溶,在甲酸中易溶,在氢氧化钠试液或稀盐酸中溶解,在酸液和碱液中较为稳定,但在存在其他氨基酸或糖类物质时则易分解。
L-色氨酸有 3种光学异构体,长时间光照易变色L-色氨酸在水中加热产生少量吲哚,在与氢氧化钠或硫酸铜共热时则产生多量吲哚图 1-1 L-Trp的分子结构Fig.1-1 The molecular structure of L-TRP2 L-色氨酸的用途L-色氨酸在生物体内不能自然合成,需要从食物中摄取,是动物和一些真菌生命活动中的必须氨基酸L-色氨酸在蛋白质中含量很低,平均含量约 1%或更少 [4]L-色氨酸能调节蛋白质的合成、调节免疫及消化功能 [5]、增加 5-羟色胺代谢作用以及增强认知能力 [6]等,因此在人和动物的新陈代谢、生长发育中有重要作用L-色氨酸的这些营养和药用价值使其被广泛应用于医药、饲料和食品等行业3 L-色氨酸的合成方法L-色氨酸的生产方法有化学合成法、转化法和微生物发酵法化学合成法由于存在工艺复杂、产品成分复杂等原因,已逐渐被淘汰而转化法( 酶转化法和微生物转化法) 虽然已经实现了工业化,但仍然存在原料昂贵、低转化率等问题以葡萄糖等廉价原料来生产色氨酸的微生物发酵法是最早开发的色氨酸生产方式,但这种方法在很长的一段时期内都无法实现工业化究其原因,主要是在早期的研究中,研究者单一依靠传统的化学或物理诱变方式选育色氨酸生产菌株; 但是色氨酸的生物合成途径存在极其复杂的调控机制,仅通过诱变方式无法根除其所有的代谢调控作用,因此在这种情况下,研究者无法获得优良的菌株用于 L-色氨酸生产。
近年来,随着 DNA 重组技术的快速发展,特别是代谢工程育种方式的兴起,研究者逐渐选育出一批高产的色氨酸生产菌株,大幅提高了微生物发酵法生产色氨酸的效率,使其成为工业上主要的色氨酸生产方法 〔7〕 本文系统综述了微生物发酵法生产 L-色氨酸所涉及的代谢工程策略,并探讨了其未来的发展趋势4 L-色氨酸的微生物合成机制4.1 微生物合成 L-色氨酸的代谢途径目前用于生产 L-Trp 的微生物种类主要有大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草杆菌、酵母等菌种各种微生物的 L-Trp 合成机制略有差异,以大肠杆菌为例,L-Trp 合成代谢包括中心代谢途径、芳香族氨基酸共同途径和 L-Trp 分支途径三个部分 [8]中心代谢途径指以葡萄糖为起始物经磷酸戊糖(HMP)途径的赤藓糖-4-磷酸(E4P)和糖酵解(EMP)途径中的磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)二者缩合形成 3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的过程;共同途径指从 DAHP 开始,经莽草酸(SHIK) 、到达分支酸(CHA)的过程;余下的从 CHA 至 L-Trp 部分,则称为 L-Trp 分支途径(图 1-2) 目前关于 L-Trp 的代谢工程研究大多集中在共同途径和 L-Trp 分支途径的改造上。
Glucose图 1-2 大肠杆菌中 L-Trp的合成途径及相关调控Fig.1-2 Metabolic pathways and regulation for biosynthesis of L-Trp in E.Coli4.2 微生物合成 L-色氨酸的调控机制色氨酸的微生物合成代谢存在复杂的调控机制,从而严格控制着色氨酸的合成4.2.1 限速酶的反馈抑制色氨酸的合成代谢中存在两个明显的限速酶: DAHP 合成酶和邻氨基苯甲酸( ANTA) 合成酶( 图 1-2) DAHP 合成酶催化中心代谢途径中的 PEP 和 E4P 生成 DAHP,严格控制着由中心代谢途径进入芳香族氨基酸共同途径的碳流量大肠杆菌的 DAHP 合成酶由基因 aroF、 aroG 和 aroH 编码的 3个同工酶组成,且这 3 个同工酶的酶活性分别受到酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制而在谷氨酸棒杆菌里,只存在两种 DAHP 合成酶,分别由 aro 和 aroⅡ 编码ANTA 合成酶则负责催化共同途径的末端产物 CHA 生成 ANTA,从而进入色氨酸分支途径ANTA 合成酶由基因 trpED 编码,酶活性受到终端氨基酸色氨酸的反馈抑制 [9] 。
4.2.2 关键酶的转录调控除酶活性受到反馈抑制作用外,一些关键酶的转录表达水平同样受到终端氨基酸的调控大肠杆菌中,从分支酸到色氨酸的合成是由色氨酸操纵子完成的在色氨酸操纵子的上游存在一个 trpR 基因,其编码 trpR 阻遏蛋白参与色氨酸操纵子的转录调控当胞内色氨酸的浓度高于某一阀值时,在 trpR 阻遏蛋白的作用下,操纵子的转录则受到阻遏此外,色氨酸操纵子的转录还受到衰减子序列的调控色氨酸操纵子序列中,在结构基因之前有一段由 162 核苷酸组成的前导序列在转录过程中,当胞内色氨酸达到一定浓度时,这段核苷酸序列的二级结构则发生变化,进而阻止操纵子的继续转录 [9] 4.2.3 转运途径调控培养液中的色氨酸被微生物转运至胞内进行吸收利用,是由特定的转运系统进行控制的在大肠杆菌中,3 个色氨酸转运基因 mtr、 tnaB和 aroP 调控着色氨酸由胞外向胞内的转运 图 1-2) 其中, mtr 和 tnaB 基因分别编码色氨酸的高亲和性和低亲和性色氨酸通透酶,均专一性调控色氨酸由胞外向胞内的吸收; 而由 aroP 基因编码一种跨质膜双向运输芳香族氨基酸通透酶,除调控色氨酸的吸收外,还参与调控苯丙氨酸和酪氨酸的吸收 [10] 。
但在谷氨酸棒杆菌中,色氨酸的吸收则仅由基因 aroP 蛋白调控 [11] 4.2.4 其他调控机制除上述调控机制外,色氨酸合成代谢还存在一些其它的重要调控机制例如,微生物还通过色氨酸降解反应以及众多竞争途径来调节色氨酸的合成大肠杆菌的 tnaA 基因编码色氨酸酶,虽然在高浓度的丙酮酸和氨条件下该酶能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成色氨酸但在正常情况下它只发挥降解色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨的作用,阻碍色氨酸的积累因此,失活 tnaA 基因有利于大肠杆菌积累更多的色氨酸 [12] 此外,在色氨酸合成途径的关键节点还存在众多的竞争途径,进一步削弱流向色氨酸合成途径的碳流量例如,对于共同途径的末端产物 CHA,除参与色氨酸的合成外,还是另外两种芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸的共同底物,此外,它还参与叶酸、甲萘醌和泛醌等的生物合成5 增强 L-色氨酸合成的代谢调控策略5.1 抗反馈抑制作用酶的帅选抗反馈抑制作用突变酶是微生物积累 L-Trp的先决条件在野生型大肠杆菌的无机培养过程中,AroG 和 AroF 同工酶的酶活占 DAHP 合酶总酶活的 99%以上,而 AroH 同工酶的酶活不足总酶活的 1%,因此,在芳香族氨基酸的菌种选育研究中,大多数研究者通过筛选抗反馈调节突变的 aroG 和 aroF 基因(aroG fbr和 aroFfbr),来解除终端氨基酸对 DAHP 合酶的反馈抑制作用。
到目前为止,许多抗反馈调节的 DAHP合酶基因已经被报道其中,抗反馈抑制的 AroF 同工酶的突变位点有:第 148 个氨基酸残基脯氨酸突变为亮氨酸 Pro148Leu;第 152 个氨基酸残基谷氨酰胺突变为异亮氨酸 Gln152Ile;N 末端第 8 个氨基酸残基天冬酰胺突变为赖氨酸 Asn8Lys抗反馈抑制的 AroG 同工酶的突变位点有:第 150 个氨基酸残基脯氨酸突变为亮氨酸 Pro150Leu;第 146 个氨基酸残基天冬氨酸突变为天冬酰胺 Asp146Asn在抗反馈调节 ANTA 合酶的筛选方面,Maureen. G 等通过化学诱变及序列分析的方法获得了一系列 Salmonella typhimurium 来源的抗反馈调节 ANTA 合酶基因中国军事医学科学院放射与辐射医学研究所的李剑欣依据 Maureen.G 等的研究成果,通过定点突变大肠杆菌 ANTA 合酶 TrpE 亚基第 40 个氨基酸残基 Ser 为 Phe,获得了完全抗 L-Trp 反馈抑制的 ANTA 合酶5.2 共同途径及色氨酸分支途径的改造芳香族氨基酸共同途径和 L-Trp 分支途径的改造主要涉及抗反馈调节作用酶(DAHP 合酶、ANTA 合酶)和其它关键酶基因(trp 操纵子、serA 等)的克隆表达;以及基因组上 TrpR 阻遏蛋白基因 trpR 和色氨酸酶基因 tnaA 的失活等。
1982 年 Aiba 等将含有 trp 操纵子的组成型质粒 Psc101 trp.I115(TrpE、TrpD 解除反馈调控)转化至 trpR 和 tnaA 双基因失活的宿主菌中,通过向培养基中流加 ANTA,发酵 27 小时菌株可以积累 6.2 g/L 的 L-Trp在此基础上,经过多轮化学诱变,菌株的产 L-Trp 能力提高至 30 g/L;通过在发酵中期添加适量的表面活性剂 L61,最终 L-Trp产量提高至 54.5 g/L,这是目前文献报道中大肠杆菌产 L-Trp 的最高产量2002 年Dodge 等将含有 trp 操纵子(TrpE 解除反馈抑制) 、aroG(解除反馈抑制)和 serA 基因的质粒 pBE7 转化至 tnaA 和 serA 基因失活的抗 ANTA 的突变宿主菌中,通过优化发酵过程中葡萄糖的流加速率,使 L-Trp 产量达到 42 g/L这是在不添加任何前体物的情况下,文献报道的大肠杆菌产 L-Trp 的最高产量国内开展 L-Trp 代谢工程育种的研究较晚,李剑欣 2007 年在质粒 pBV220 中引入解除反馈调控的 aroG 和 trpED 基因,并转化至已敲除 trpR 和 tnaA 基因的大肠杆菌 K-12 中,摇瓶发酵后产 L-Trp 0.168 g/L。
在谷氨酸棒杆菌的 L-Trp 菌种选育研究中,1975 年 Hagino 和 Nakayama 获得一个 L-Tyr 和 L-Phe 缺陷型菌株 KY9456,通过多次诱变筛选后,仅能积累 12×10-3g/L 的 L-Trp但以此为基础,1993 年 Katsumata 和 Ikeda 在菌株中引入质粒 pKW99,共表达已解除反馈调控的 DAHP 合酶基因和 trp 操纵子,结果 L-Trp 的产量大幅提升至 43g/L,且伴随吲哚的积累1994 年 Ikeda 等在质粒 pKW99 中进一步扩增了丝氨酸合成代谢中的关键酶基因 serA,消除了吲哚的积累,将 L-Trp 的产量进一步提高至 50 g/L在国内, 2007 年西北大学的陈俊峰从土壤中分离得到一株谷氨酸棒杆菌 JXQ3-28,产 L-Trp 0.8 g/L;后经多次诱变获得了 L-Tyr 和 L-Phe 双缺陷型菌株 SG-116,发酵 90 h,产 L-Trp 10.2 g/。