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1、,第八章 克隆基因的表达,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,一、基因表达：,二、克隆基因的表达：,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,用原核生物作宿主,A dividing E. coli,第一节 外源基因在原核细胞中的表达,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。,数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。,一、原核生物基因表达的特点,2. 以操纵子为单位,1. 只有一种RNA聚合
2、酶,5,3,转录,mRNA,5,3,翻译,蛋白质,N,C,5,3,3. 转录和翻译偶联、连续进行。,4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。,5. 调控主要在转录水平上。,含有一个启始密码子和一段同核糖体16SrRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,6. mRNA的核糖体结合位点,Shine-Dalgarno（S-D）sequence:,二、原核表达系统的注意事项!,外源基因不能带有内含子。,2. 必须用cDNA,3. 不能直接用真核基因组DNA。,4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）,5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。,是DNA上的能与RN
3、A聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,三、原核生物基因表达的调控,1. 启动子,-35 Box 和 -10 Box,（1） 启动子序列,consensus sequences,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3, -10box（Pribnow Box）,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,RNA聚合酶 亚基的识别位点 。, -35box,原核启动子共有序列的功能,（2）翻译的起始位点,核糖体结合位点（ RBS）,1）Shine-Dalgarno（SD） sequen
4、ce：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,ribosome binding site,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）,位于SD序列下游。,ii）起始密码：,2. 转录终止子,内终止子,intrinsic terminator：,E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。,在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。,启动子,操纵子,S-D序列,目的基因,终止子,由于茎环3段紧接一串A/U的配
5、对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,原因：,反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作, 茎环结构, 多聚A/U,5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板),转录,5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA),RNA折叠,mRNA折叠,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A
6、 A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA聚合酶,脱落,大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。,4. 翻译增强子,Translation enhancer,能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。,T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。,21,3 .翻译终止密码, 必须是一种强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。,应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导。,（1）最佳启动子必须具备的条件,5. 基因工程常用的原核启动子 p87,来自大肠
7、杆菌的乳糖操纵子。,用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。,Plac,O,目的基因,（2） 乳糖启动子lac,（3）色氨酸启动子trp,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,trpR,阻遏蛋白基因；,P1,P2,启动子；,O,操纵基因；,衰减子,来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,邻氨基苯甲 酸合成酶,吲哚甘油 硼酸合成酶,色氨酸 合成酶,链,链,分支酸,邻氨基 苯甲酸,磷酸核糖基 邻氨基苯甲酸,CDRP,吲哚甘 油-磷酸,色氨酸,阻遏物,转录,（P1是主要启动子
8、，P2的作用只有3%。）,没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,阻遏物,色氨酸,结合,不转录,用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。,P1,O,trpE,目的基因,有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为corepressor）。,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1. 细胞质中表达,（1）包涵体（inclusion body） P93,是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,
9、形成原理未知。,在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。,例：,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,回收的蛋白生物活性差。, 缺点, 优点,2. 周质中表达,（1）周质（periplasm）,格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚,优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等,（3）常用的原核信号肽,大肠杆菌的信号肽：,
10、能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。,（2）信号肽（signal peptide）,鼠源RNase、人生长激素信号肽。,也能在细菌中起作用。,（2）真核信号肽,胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。,由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,3. 胞外表达,或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。,载体表达出的外
11、源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点,五、几种类型的原核表达载体,1. 非融合型表达载体,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,缺点：,容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。,（1）pKK223-3 载体P87,组成结构：, 强启动子: tac（trp-lac）:,trp的-35区,lacUV5的-10区,lac操纵基因,操纵基因：,乳糖操纵子系统。,终止子：,调节基因：,Lac I,宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。,rrnB的强终止子,rrnB强终止子,S-D,插入位点区,S-
12、D序列和插入位点区：,tac P,Lac O,S-D,插入位点区,rrnB T,宿主lac I,载体的其余部分：,来自pBR322质粒。,表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,阻遏物,IPTG,必须选择一个有lacI的宿主菌。,条件：,载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,2. 分泌型表达载体P92,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）组成结构,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位点,Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动
13、子。,调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG。 分泌信号肽：,大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。,插入位点区（多克隆位点）。, 强启动子：,pIN III-comA1,以pBR322为基础构建的。 调节基因不必借助于宿主的lacI.,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。,启动子：tac 操纵基因：lacP 调节基因：lacI S-D序列,3. 融合蛋白表达载体系统-pGEX系列P90,（1）优点,（2）组成结构,便于融合蛋白的分离和纯化。,22,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,ori：pBR322 ori 融合肽
14、：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,（3）产物提纯,（4）产物分离,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,柱（column）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,pGEX,插入区：,pGEX-1T,CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA,Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp,EcoR I,B
15、amH I,凝血酶,CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACG,Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp,EcoR I,BamH I,凝血酶,ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGAC,Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser,EcoR I,BamH I,Xa因子,pGEX-2X的插入区：,pGEX-3X的插入区：,Sma I,Sma I,（5）其他融合蛋白系统P91,His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3, -35box, -10box（Pribnow Box）,六、影响外源基因表达效率的因素,1. 启动子的结构对表达效率的影响,RNA聚合酶 亚基的识别位点,（1）一致顺序,（2）-35区与-10区之间的距离,间隔为17bp时，启动子最强。,（3） -35区和-10区的碱基顺序,越接近一致顺序，
