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1、前DC细胞的研究进展情况日期：2011-01-28 来源：新桥医院肿瘤生物治疗中心 责任编辑：叶主任 咨询详情机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)捕获、加工和处理抗原,再将抗原递呈给T,B淋巴细胞,从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为功能最强的APC,能激活静息型T细胞(na?ve T cell),激发初始免疫应答,在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷,不能有效递呈肿瘤抗原,导致免疫无能或免疫耐受,使肿瘤得以发生发展1。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应
2、用于DC瘤苗构建方法的发现,DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟,DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。本文就DC的免疫学活性、抗原摄取和递呈途径、体外诱导扩增及其瘤苗构建和应用的研究进展进行综述。1、DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础DC在体内分布广泛,普遍存在于除脑组织外的各种组织和器官中,在遇到外来抗原时可捕获、处理抗原。处于组织间隙的DC为未成熟DC(immature dendritic cell,iDC),被认为是次级淋巴组织T细胞富集区域中存在的成熟DC(mature dendritic cell,mDC)的前体,具有强大的抗原摄取能力2,但因其表面
3、表达低水平的MHC类,MHC类及共刺激分子,因而不能有效的将抗原递呈给T淋巴细胞,对T细胞的刺激能力较低。捕获加工处理抗原后,iDC丧失抗原摄取能力,向次级淋巴器官迁移,同时逐渐成熟。mDC表面共刺激分子(CD80,CD86)、MHC类分子、T细胞黏附分子(CD48,CD58)表达上调,其利用内吞抗原有效合成MHC类分子肽复合物的能力也得到进一步加强,并分泌一些细胞因子,如IL-1,IL-6,IL-12,IL-18等。DC通过巨胞饮作用(macropinocytosis)、吞噬作用及受体介导的内吞作用来摄取抗原3。外源性抗原被DC摄取处理后,与MHC类分子结合,并借助高表达的共刺激分子CD 8
4、6等将抗原多肽递呈给CD 4+T细胞,促使其发生克隆增殖分化,并分泌IL-12以加强免疫应答。与MHC类抗原递呈途径相比,对MHC类抗原递呈研究较少。MHC类分子不聚集于iDC表面,但是其膜表面表达水平在成熟过程中被上调,同时可能有部分伴随着MHC类分子到达细胞表面。MHC类分子限制的抗原被递呈给CD 8+T细胞,诱导机体产生抗原特异性CTL,在抗肿瘤免疫中意义重大。2、DC的体外大量诱导扩增是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的前提虽然DC在体内分布广泛,但数量极少,外周血单个核细胞中DC的比例还不到1%,在淋巴器官中虽数量较多但难以收集,而且由于分离出的DC具有异质性,难以满足对DC的基础研究及临床应
5、用的需要。此外,体内的DC因为肿瘤分泌的一些因子,如IL-10,TGF,VEGF限制其成熟而发生功能缺陷。因此,利用DC的前体细胞体外诱导分化扩增DC是研究DC瘤苗的必要途径。2.1CD34+干细胞诱导分化扩增DCCD34+干细胞可从骨髓(bome marrow,BM)、脐血(cord blood,CB)、外周血(peripheral blood,PB)分离纯化而来。CD34+干细胞在GM-CSF和TNF-的作用下可增殖分化为DC,而c-kit配体可提高DC的产量,肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和PMA也是有效的DC分化扩增激活因子5。Hogihar
6、a等6利用鼠基质(HESS-5)建立了一种新的DC培养体系,利用这种培养体系从CD34+脐血(CB)中诱导扩增出DC,未成熟及成熟的CB-DC分别具有葡聚糖摄取能力及有效的刺激异基因淋巴细胞增殖能力。为了探讨由不同来源的CD34+干细胞诱导分化的DC在表型及功能上是否有差异,Servido7将体外诱导的CD34+BM-DC及CD34+PBSC-DC进行多方面的比较,如细胞内吞能力、混合白细胞反应、免疫表型分析等。结果发现,与BM-DC相比较,PBSC-DC不能摄取可溶性抗原,但是混合白细胞反应强,表面共刺激分子表达更高。他们认为, BM-DC可用来负载特异性抗原肽,而功能上比较成熟的PBSC-
7、DC更适合应用于基因治疗。2.2单核细胞诱导分化扩增DCGarderet等8总结了外周血单核细胞体外诱导扩增DC的基本过程,包括用白细胞提取法收集外周血单个核细胞,淘选法分离单核细胞,人血清培养基(含患者自体血清或AB血清)或无血清培养基+GM-CSF+IL-4与单核细胞共同培养。另一种方法就是从脐血单核细胞诱导扩增DC 9,培养条件与外周血单核细胞诱导DC相同。比较这些CB黏附细胞来源的DC (CB-DC)和PB黏附细胞来源的DC (PB-DC)的表型和功能后发现,第7天的CB-DC表达较低水平的CD80, CD1a, CD83和CMRF-44,但刺激异基因脐血淋巴细胞和外周血淋巴细胞增殖的
8、能力与PB-DC相似,成熟前摄取吞噬FITC葡聚糖的能力也与PB-DC相当。到目前为止,大多数研究应用单核细胞起源的DC (MoDC)。在体外使大量单核细胞分化为DC,虽然需要外源性细胞因子刺激和较长培养时间(6d或更长),但是因其具有产量大、纯度高、易获得等优点,更能满足实验和临床研究的需要。2.3白血病细胞诱导分化扩增DC抗原递呈是肿瘤免疫的关键环节。若能将白血病细胞直接诱导分化为DC,则DC表面既能高表达MHC类分子及共刺激分子,又能表达白血病抗原,在DC瘤苗抗白血病免疫中发挥巨大作用。有人曾尝试利用细胞因子组合诱导白血病细胞株(KG-1)分化为DC 10,诱导出的细胞形态不规则,膜上有
9、明显的树突状突起;表型上,表达MHC类分子,共刺激分子CD80, CD86, CD83;功能上具有吞噬乳胶颗粒和诱导异基因T淋巴细胞反应能力。从急性髓性白血病患者体内分离出的白血病细胞亦可在体外被诱导分化为DC 11,从一位急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者体内分离出的白血病细胞与GM-CSF+IL-4+TNF-共培养10d后,表现出典型的树突状细胞特征,其白血病起源可由t(15;17)的DNA探针进行原位杂交来证实。3、DC瘤苗的体外构建是DC瘤苗的抗肿瘤免疫治疗的关键体外进行抗原负载的DC回输后可打破对肿瘤相关抗原的耐受,并且可以诱
10、导体内的抗肿瘤细胞毒性免疫应答。在DC的功能研究及体外培养技术得以发展的基础上,大量的研究方向集中在完善对抗原的负载即DC瘤苗的构建上。3.1抗原肽冲击构建DC瘤苗3.1.1已知抗原肽冲击DCDC在体外可被合成肽或来自肿瘤相关抗原(tumor associdted antigen,TAA)的蛋白冲击致敏,这些TAA包括MAGE-1,MAGE-3,MUCI,Her-2/neu,CEA,Melan/MART等。这些抗原肽可被直接应用,也可在其表位锚点进行单一氨基酸替代以便与MHC类分子更紧密结合,增强其诱导CTL反应的能力。对16例处于进展期的黑色素瘤患者的研究发现12,HLA-A2结合的抗原肽(
11、tyrosinae,Melan-A/Mart-1或gp100)或HLA-A1结合的抗原肽(MAGE-1/MAGE-3)联合KLH冲击致敏MoDC,回输后所有患者都发生了针对KLH的迟发性超敏反应(DTH),11例发生针对抗原肽的DTH。独特型蛋白(Idprotein)可通过DC的交叉递呈(cross presening)激发Id特异性CD4+T细胞,通过Id负载的DC回输,可诱导B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者体内针对独特型的体液和细胞反应13。3.1.2全肿瘤抗原冲击DC由于只有一部分肿瘤的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原已知,大部分肿瘤尚未明确,因而将整个肿瘤细胞作为抗原来源不失为一种可取的方法
12、。例如将DC与肿瘤溶解物14,凋亡或坏死细胞共培养15,或将DC与肿瘤细胞融合16,将白血病原始细胞诱导为DC,使之既具有DC特征,又表达白血病抗原10,等等,均已有报道。在鼠模型中14,体外用负载了肿瘤溶解物的DC作为刺激剂可驯化同系鼠T细胞,导致肿瘤特异性T细胞增殖及细胞因子的产生;在临床实验中,负载了黑色素瘤细胞溶解物和匙孔血蓝蛋白(KLH)的DC疫苗免疫后产生了KLH特异性T细胞反应,并产生记忆性CTL。将肿瘤细胞与DC细胞融合,可以获得既具有DC特殊功能又表达肿瘤抗原的杂合体,这种杂合体细胞表达MHC, MHC类抗原,协同刺激分子以及DC特异性或肿瘤细胞表面分子,输注以后可以产生抗瘤
13、作用。3.2基因转染构建DC瘤苗3.2.1抗原基因转染DC将编码肿瘤抗原的DNA和RNA分子转入DC可提供较大范围的抗原表位递呈,并且增加了MHC类和MHC类分子递呈抗原肽的能力,HLA限制性的抗原选择也可被避免。而且,肿瘤抗原编码基因导入DC后能在DC内持续表达肿瘤抗原,可以克服由于DC上抗原MHC复合物解离或细胞MHC分子降解对其诱导T细胞免疫应答产生的不利影响。把这种DC瘤苗应用于动物模型,已成功观察到肿瘤的退行性变。Zum等17通过逆转录病毒将肿瘤相关抗原HER2转导入DC,将来自一名伴有HER2过表达的乳腺癌患者的T细胞成功诱导扩增为HER2特异性CTL和Th1克隆。另外,也可将差异
14、筛选获得的肿瘤特异性表达的mRNA导入DC,用于肿瘤的免疫治疗,这样既可避免诱发自身免疫性疾病,又可诱导强烈的特异性抗肿瘤免疫应答。3.2.2免疫辅助分子基因转染DCDC也可被编码免疫调节因子的基因转染,如细胞因子(IL-2, IL-12, IL-18,GM-CSF)以及共刺激分子(B7)等,转染后的DC可以更强的诱导免疫应答。利用腺病毒载体将CD40转导入DC输入荷瘤鼠体内,可诱导出保护性抗原特异性免疫应答,并且可阻止DC产生自然凋亡及Fas-FasL诱导的凋亡,拮抗IL-10等对DC功能的抑制作用。Nishioka等18将IL-12基因修饰的DC细胞直接注入黑色瘤和肉瘤小鼠模型的肿瘤病灶中
15、,可以诱发抗肿瘤免疫, IL-12基因的转染可以促进DC细胞的成熟,表现为MHC, MHC和共刺激分子的表达增加。利用基因工程技术构建DC瘤苗面临的一个难题就是转导率不高。为了提高转导率,研究者作过多种尝试。Nishimura等19比较了在不同时间,不同速度,不同转速下离心力加强腺病毒介导的基因转导效率后发现,最好的离心转导条件是:RS2000xg,T37,Tm2h,MOI(high multiplicity of infaction)10。转导率提高达86%以上。而Viggo 20报告,mRNA电穿孔与质粒DNA电穿孔相比有明显提高的转导率,前者转导率为89%,后者则为40%。更重要的是,编
16、码Melan-A的mRNA电穿孔的CD可强烈激活Melan-A特异性的CTLs克隆增殖,优于mRNA脂质体转导的DC或mRNA直接冲击的DC。DC细胞的研究进展，肿瘤生物治疗网为你介绍。 总之, DC瘤苗是肿瘤免疫治疗的新方向,可行性试验已证实抗原冲击的DC可用来激发体内的抗原特异性T细胞反应,临床,期试验也取得了可喜的成就。但是DC瘤苗真正广泛应用于临床尚有一段距离,必须解决以下问题:数量大纯度高的DC的诱导;特异性肿瘤抗原的选择; DC瘤苗构建方式的改善;合适的DC瘤苗回输时间、方式、剂量的选择等等。随着DC瘤苗进一步研究的开展, DC瘤苗应用于临床肿瘤免疫治疗指日可待。肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，手术、放疗、化疗等传统治疗方法难以杀灭体内残存的肿瘤细胞。涟江为区内地表水的主要排水通道，隧道设计标高高于最低
