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1、实验七 酵母菌的形态观察、 大小测定和直接计数,目的要求： 1、观察酵母菌的形态及出芽生殖，学习区分酵母菌 死活细胞的实验方法。 2、 学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 3 、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。,1、基本原理： 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有性繁殖通过接合产生子囊孢子。 美蓝是一种无毒性的染料。它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此酵母活细胞是无色的，而死细胞或衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，以此进行鉴别。,一、
2、.酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别,美蓝浸片的观察： （1）在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均匀。 （2）加盖玻片。注：不要产生气泡。 （3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色区别死、活细胞。,2、操作技术,（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。 （5）绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并计算0.5h后酵母菌的死亡率。,酵母菌,1、基本原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定需借助测微尺-目镜测微尺和镜台测微尺。,二.
3、微生物大小的测定,镜台测微尺： 是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分为100小格，每格长0.01mm。用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺： 是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，测量时，需要将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。,由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞的实际大小。 球菌
4、用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范 围来表示。,（1）装目镜测微尺(换目镜) 把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。 （2）校正目镜测微尺： 1）放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。,2.操作技术,2）校正：先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。 用同样的方法换成高倍镜进行校正，测出在高倍镜
5、下，两重合线之间两尺所占的格数。,3）计算：目镜测微尺每格长度（um）=两重合线间镜台测微尺格数x10 / 两重合线间目镜测微尺格数 （3）菌体大小测定：目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母菌染色制片。先在低倍镜下找到标本，换高倍镜测定酵母菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌的直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（在高倍镜下）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。 （4）测定完毕：取出目镜测微尺后，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦试干净，放回盒内保存。,1、基本原理 显微镜直接计数法是将小量待测样品
6、的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。,二、显微镜直接计数法,用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。 该计数板是一块特制的载玻片，其上有四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。,计数室规格： 25（中格）16（小格） 16（中格） 25 （小格） 每种规格计数室
7、中的小方格都是400个。 计数室大小： 每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。,25X16,16X25,（1） 菌悬液制备 以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 （2）镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。 （3） 加样品 将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将要摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。 取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。,2、操作步骤,（4）显微镜
8、计数 加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。 调节显微镜光线的强弱适当，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。,由此处注入,每一中方格的周围皆有三条边线，计算单一中方格的细胞数时，位于边线上的细胞计算方式为：以第二条边线(简称中线)为界，接触到左侧中线与上端中线的细胞要算，接触到右侧与下端中线的细胞则不列入计算。如上图，若每一个圆圈皆代表活细胞，空心的要算，而实心的不算。,菌液浓度要适当，一般样品稀释度要求每小格约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。,（5） 清洗血细胞计数板 使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吸水纸轻轻吸干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。,三、记录实验结果 (1) 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并计算 0.5h后酵母菌的死亡率。 (2) 填写目镜测微尺校正结果（10倍及40倍下）。 （3）填写啤酒酵母的大小测定结果。 （4）填写用血球计数板计数的结果。,
