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1、二氧化钛纳米颗粒对废水脱氮除磷的效果以及对活性污泥中细菌群落改变的长期影响熊正1 陈银光* 吴瑞2同济大学 环境科学与工程学院 污染控制与资源再生国家重点实验室，中国上海市四平路1239号，摘要：二氧化钛纳米颗粒（TiO2NPs）在很多领域的广泛应用引起了人们对其在环境中的潜在影响问题的关注。然而，人们在TiO2NPs对生物脱氮除磷以及活性污泥中细菌群落影响的领域的调查研究确是很少的。本实验是针对TiO2NPs在厌氧序批式反应器处于低溶解氧（0.150.50mg/L）环境下对于生物营养物质去除率的影响的评价。研究发现，150mg/L浓度的TiO2NPs在与废水经过短期接触（1天）的情况下，对水
2、体脱氮除磷不具有明显的效果。然而，研究观察显示，50mg/L浓度（高于其在环境中的相关浓度）的TiO2NPs却使水体总氮的去除率出现明显的下降，在与废水经过长期接触反应（70天）后，总氮的去除率从80.3%降到24.4%，反之，生物除磷效率却没有受到影响。变性梯度凝胶电泳图谱显示50mg/L浓度的TiO2NPs明显减少了活性污泥中的微生物种群多样性。荧光原位杂交分析结果表明，大量的硝化细菌，尤其是氨氧化菌在TiO2NPs与废水充分接触反应后出现急剧死亡，这也就是氨氧化菌急剧退化死亡的主要原因。进一步的研究显示，50mg/L浓度的TiO2NPs在与废水长期充分接触之后抑制了氨单氧酶和亚硝酸盐氧化
3、还原酶的活性，但是却对外切聚磷酸酶和多聚磷酸盐激酶没有明显的影响。同时，TiO2NPs对于细菌细胞中的聚羟基脂肪酸酯和糖原的转变的影响也与实验所观察到的生物脱氮除磷的影响规律保持一致。引言纳米材料因其特殊的物理和化学性质而被广泛的应用在大量的工业生产和消费产品中。1特别是TiO2NPs被广泛的应用在了催化剂、遮光剂和水处理工艺中。2这些TiO2NPs的广泛应用无疑会在环境中产生残留。最近，人们在土壤、地表水、排污废水以及城市污泥中均发现有TiO2NPs的存在。3,4这些现象使得TiO2NPs对环境的潜在影响逐渐为人们所关注。尽管TiO2NPs目前在环境中的预估浓度只处于ug/L级，4,5但是随
4、着它们在大规模产品生产中的应用，TiO2NPs在环境中的残留会持续增加。结果现在许多项研究都在致力于调查研究TiO2NPs在处于mg/L级时对有机体，比如人体细胞6、斑马鱼7、海洋浮游生物8以及微生物9等的毒害作用。例如，研究证明，0.14mg/L浓度的Ag NPs就会对硝化细菌的呼吸作用产生抑制作用10，但是10mg/L浓度的Cu NPs却不会对氨氧化菌的呼吸作用产生抑制作用11。以前的研究工作都是针对纳米材料对细菌呼吸作用的影响的研究。近期的研究表明，ZnO NPs可以对活性污泥产生显著影响12。但是其他的纳米材料却不会对活性污泥中的微生物产生有利的影响。尽管有数据显示，在未经处理的废水中
5、发现0.13mg/L的Ti存在13，但是TiO2NPs对于废水脱氮除磷效率的潜在影响仍然是未知的。现今人们对TiO2NPs的毒害作用大部分是来源于对有机体模型的研究。西蒙德克尔等人认为TiO2NPs在500mg/L的浓度下与耐金属贪铜菌接触反应24h后仍对其没有影响，与枯草杆菌接触6h后对其生长也没有任何影响。9不过这些实验都是TiO2NPs与受试体在短期（通常为124h）接触反应后得到的，这样只能表现出TiO2NPs对于细胞活性和细菌模型生长的急性影响。延长接触反应时间（3个月）可以观察出TiO2NPs对人体角质细胞产生一些不利影响，例如减弱细胞线粒体的活性或者失去正常的细胞形态，但是同样浓
6、度下的TiO2NPs在短时间的接触反应下不会体现出对角质细胞的影响6。但是只片面的考虑纳米材料的急性影响对于研究纳米材料对环境的潜在危害是不足的。因此评估TiO2NPs对生物脱氮除磷的影响需要从长期接触反应和短期接触反应两种情况来调查研究。众所周知，活性污泥法处理废水脱氮除磷工艺是靠硝化细菌和反硝化细菌来脱氮，靠好氧菌和厌氧菌来除磷15,16。因此，要实现高效生物脱氮除磷效率，微生物种群的多样性和稳定的细菌群落结构起着重要的作用。然而，到目前为止，TiO2NPs的长期接触暴露是否会影响活性污泥中的细菌群落仍然是未知的。这项研究的目的是：（1）评价TiO2NPs对废水脱氮除磷效果的影响；（2）通
7、过聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳相结合的方法（PCRDGGE）来分析经过长时间暴露接触TiO2NPs后，活性污泥中微生物群落的变化情况；（3）探索TiO2NPs对细胞内聚羟基脂肪酸酯（PHA）和糖原的转变的作用，以及对一些可以去除生物营养物质的关键酶活性的影响，例如氨单氧酶（AMO），亚硝酸盐氧化还原酶（NOR），硝酸盐还原酶（NAR），亚硝酸盐还原酶（NIR），外切聚磷酸酶（PPX）和聚磷酸铵激酶（PPK）。本文采用厌氧低溶解氧（DO：0.15-0.50mg/L）的废水处理工艺来实现生物营养物的去除，因为这项技术可以节省能源，减少氧气供应同时实现高的生物营养物质去除率。材料和方法纳米颗粒悬
8、浮液的制备：这项研究中用到的市售二氧化钛纳米粒子（），在通过配备有旋转阳极和铜氪辐射源的X射线衍射器（XRD）检测分析后被认定是纯锐钛矿（图S1，辅助信息（SI）。在华氏摄氏度77K下，通过微粒学三星3000测试仪并采用比表面积氮吸附的方法，可以测出TiO2NPs的比表面积为1068 m2/g。根据相关文献记载，为了产生100mg/L的纳米颗粒悬浮物，需在25摄氏度、250W和40KHz的条件下，将100mg的TiO2NPs采用声波降解法放入1L的超纯水中达到一个小时。据西格玛奥瑞奇报道，虽然TiO2NPs的颗粒尺寸小于25纳米，但在纳米颗粒悬浮物中，通过通过莫尔文授权的动态光闪射分析，颗粒的
9、原始尺寸是在70至90纳米的范围内定义的。SBRs的建立和长期分析在这个研究中，TiO2NPs的环境相关浓度为1mg/L。同时50mg/L浓度的TiO2NPs的潜在影响也需要调查研究，因为大规模的生产，TiO2NPs在环境的残留也许不断增加 4,13 。为了推进实验，三个SBRs用来容纳1L的人工合成废水和1L的从一个原有的已超过100天且已达到了稳定移除生物营养的SBR中获得的接种污泥（大约80%的氮和90%的磷被移除）。 然后，SBR1和SBR2分别提供40ml和2000ml的TiO2 NPs悬浮液（密度为100mg/l），而SBR3不提供TiO2 NPs作为参照。最后，去除离子的水加入至
10、容器中，使每个SBR的反应体积达到4L。每个SBR分为一式三份，并覆盖铝箔以避免可能的光线影响，同时维持在211度达三个小时。此条件每天循环3次。伴随着1小时的沉降、10分钟的减压和140分钟的闲置时段，每一个循环又包含1.5小时的厌氧环境阶段和3小时的低溶解氧阶段。操作时间从TiO2 NPs加入时开始算起。在每一个反应器中计算TiO2的总浓度后，由于排放物和泥土因素，SBR1和SBR2中的TiO2 NPs浓度可能会逐渐降低，因此每两天需要补充一定量的TiO2 NPs以恢复到最初的浓度值。在每一次循环的前15分钟内，SBRs 由3L的人工合成废水组成（包含1.1ml醋酸、2.9ml氮水、1.4
11、ml磷水、10ml浓缩水和2ml微量元素），以达到最初的COD、 NH4+-N和各自大约300、25和10mg/L的SOP浓度。 由氮水、磷水浓缩水和微量元素组成的混合物在国际制单位中有细化。通过添加4M NaOH和4M HCl，PH影响值需调整到7.5。在低溶解氧阶段，空气用一个ON/OFF控制的在线检测器间歇的提供，以保证溶解氧维持在0.15 and 0.50 mg/L之间。在低溶解氧阶段的末尾前，大约22天左右，泥土被耗费用来保持固体停留时间。降沉阶段之后3L的上层清液被排出。为了沉降、解压和闲置阶段，所有的SBRs用电磁搅拌器不断的混合。在所有SBRs的废水中，NH4+-N、NO2_-
12、N、NO3_-N和SOP的浓度直到氮和磷的移除达到相对稳定后才能定量。（大约70天）图1 在不同TiO2NPs浓度条件下长期作用对（A）NH4+-N（空符号）和NO3_-N（实符号） （B）NO2_-N（空符号）和SOP（实符号）废水浓度的影响 所有一式三份测量量的标准差小于21%经过短时间和长时间的暴露后，一个循环中氮和磷转化量的调查这个实验分别在第1天（短时间暴露）和第70天（长时间暴露）进行，以此来评价TiO2在氮和磷转化在短时间和长时间两方面的各自效果。首先，4L的人工合成废水按照氮和磷均等的分量来悬浮SBR1、SBR2和SBR3中的活性泥土。但在此之前，需用0.9%的NaCl溶液对S
13、BRs中的活性泥土冲洗三次。其他所有的专业条件应与在SBRs部分描述的条件相同。在厌氧和低溶解氧阶段，需要测量的变化量包括：NH4+-N、NO2_-N、NO3_-N、SOP、PHA、糖原；需要测量的活性包括：AMO、 NOR、 NAR 、NIR 、PPX和 PPK。在活跃阶段关于细菌群落的聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳分析活性阶段的细菌基因组DNA根据我们先前所述19首先进行提取。简单来说，2ml的混合物用离心机分离，再用缓冲液冲洗三遍（缓冲液的成分为8%的蔗糖，5%的聚乙二醇辛基苯基醚，50mM乙二胺四乙酸和50mM三羟甲基氨基甲烷，pH=8.0），再用360L缓冲液重新悬浮。在加入40L
14、的熔接酵素溶液（50 mg/mL）之后，然后在37摄氏度下保温10分钟。接着加入20L的10%SDS和2L蛋白酶钾（20 mg/mL），再在37摄氏度下保温60分钟。再然后，加入50L的5M NaCl和50L10%的CTBA后，在65摄氏度下保温10分钟。最后单独地，0.5ml酚-氯仿-异戊基酒精（25:24:1）和0.5ml氯仿-异戊基酒精（24:1）作用于另外的DNA。然后，在4摄氏度和1个小时的条件下，0.5 mL of 3 M 乙酸钠（pH=5.2）和1ml乙醇作用于沉淀DNA，然后在12000g条件下离心十分钟。结束后，用500L70%的乙醇冲洗微粒。最后，在50L的缓冲液中重新悬浮
15、。萃取出来的DNA用1%的以溴化乙锭做染色分析的琼脂电泳来检测，然后以此作为模板DNA进行PCR扩充。根据文献20，提取出的DNA可变V3区域中，16S核糖体DNA用引物华氏341度进行扩大。聚合酶链式反应扩增在一个总体积25L包含了10ng模板DNA的空间中进行。该空间是一个利用埃普多夫扩增梯度的，具有1 U Ex聚合酶的1EX库尔德反应缓冲区。这个应用项目由最初的变性阶段组成。该阶段的步骤为94摄氏度下持续5分钟，然后该温度下持续30秒的30次循环，58摄氏度持续30秒的高温退火和72摄氏度下持续30秒的延展，最后是该温度下持续10分钟的延展。用一个一维代码突变检测系统（BioRad），在
16、恒定电压80V、60摄氏度持续15小时的条件下，在30%到60%变性剂梯度范围的1TAE缓冲区内，PCR的产物能够在8%聚丙烯酰胺凝胶的作用下能够产生电泳。然后就会出现显著的分支从基因上分离出来，接着回收DNA的清除处理被放大、去除并克隆到pMD19-T向量上，同时通过一个叫ABIPRISM 3730的自动化DNA定序器使其变得有序。通过这一研究得到的序列符合基因数据库编号从JF到JF部分，并且最接近用BLAST程序搜索到的序列。分析方法NH4+-N、NO2_-N、NO3_-N（总氮）、SOP、混合物悬浮固体（MLSS）和悬浮固体浓度（MLVSS）的决定量是依照一定的标准方法21得到的。PHA（包括PHB、PHV和PH2MV）和糖原是根据我们现场所示的理论19来测量的。AMO、 NOR、 NAR、NIR、 PPX、 PPK、 TiO2 NPs、TiO2 NPs分解、LDH分
