《最佳呼吸机设置生理和病理学基础》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最佳呼吸机设置生理和病理学基础（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、最佳呼吸机设置的生理 和病理学基础,西京医院心血管外科ICU 崔 勤,为什么必须改变呼吸机设置的理念?,为什么需要肺复张治疗?,死亡率变化趋势,为什么需要改进ALI和ARDS定义?,患者特征,（ARDS定义）,急性发作 在不考虑PEEP水平的情况下PaO2/FiO2200 mmHg 胸部正位X线或CT示双侧浸润 PAWP18 mmHg或无左房高压的临床证据,2.1患者特点 原理：为什么不完全接受ARDS的AECC定义？,急性发作 胸部正位X线或CT示双侧浸润 PAWP18 mmHg或无左房高压的临床证据,病毒载体 非病毒载体,引起免疫反应 容量小、制备困难无靶向性,裸DNA直接注射 磷酸钙共沉
2、淀 脂质体,设备昂贵 不适合大量细胞的转染,转染率低 已很少使用,细胞毒性 抑制外源基因的表达 致DNA失活,纳米材料,壳聚糖的研究现状,体外转染安全高效 大鼠体内实验表明半乳糖基化壳聚糖有肝靶向性 大型动物体内基因转导实验尚无文献报道,研究背景,三、研 究 内 容,研究内容,大量提取 纯化质粒,chitosan,纳米微囊,体外转染 7721细胞,GdCl3 iv,体内注射,取主要脏器组织，检测报告基因表达,第一部分,研究内容,壳聚糖质粒DNA复合物的制备,实 验 方 法,质粒的酶切鉴定,研究内容,图2. pEGFP-N1质粒图谱，下方为MCR,研究内容,图3.pBIND质粒图谱，右侧为其MC
3、R,研究内容,质粒的大量提取与纯化,QiagenTM Endo-Free plasmid Giga Kits,无内毒素 纯度2氯化铯梯度抽提,壳聚糖DNA复合物（纳米微囊）的制备,研究内容,质粒DNA,50mmol/L Na2SO4,0.02 chitosan,Vertex(2500rpm) 30s,实 验 结 果,研究内容,1 2 M,图4.质粒酶切产物电泳图。1为pBIND，2为pEGFP-N1，M为DNA 100bp ladder Marker,67bp,34bp,研究内容,M 1 2 3 4,图5.纳米微囊及质粒DNA电泳图。M为marker， 1、3分别为pEGFP-N1，pBIND
4、质粒DNA， 2、4分别为含pEGFP-N1/pBIND 的纳米微囊,壳聚糖DNA在7721肝癌细胞中的表达,研究内容,第二部分,实 验 方 法,研究内容,细胞培养与细胞爬片制作,SMMC-7721细胞 0.25胰酶消化，加 1-2 滴至 12 孔板中的盖玻片上，37孵箱放置 1 h，使细胞贴壁,研究内容,用壳聚糖质粒（pEGFP-N1）纳米微囊转染，以脂质体LipofectamineTM 2000包裹相同的质粒作为阳性对照,转染,检测报告基因表达情况,DAPI溶液染色 荧光显微镜下观察 在同一视野下，分别计数绿色荧光蛋白表达的细胞数和DAPI染色的细胞数，计算转染率,研究内容,统计学分析：,
5、所得数据处理用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，用两样本均数比较的 t 检验 p0.05为差异有统计学意义,研究内容,实 验 结 果,图6. 7721细胞中GFP的表达 200,图7. 7721细胞DAPI染色 200,研究内容,表1 壳聚糖组和脂质体组的转染率（）,壳聚糖组,脂质体组,58.3,54.7,60.42.2 *,55.61.6,分组,视野2,转染率值,*p0.05 vs 脂质体组,S,研究内容,视野3,视野1,62.8,60.2,57.5,54.6,讨 论,本实验结果提示壳聚糖体外转染的效率略高于转染试剂脂质体，说明壳聚糖是一种有效的体外转染材料,为下一步体内实验打下良好的
6、基础,研究内容,壳聚糖肝靶向性基因转导体内实验,研究内容,第三部分,实 验 方 法,实验动物与分组,研究内容,杂种犬6只，第四军医大学实验动物中心 随机分为2组,实验组注射壳聚糖质粒纳米微囊 对照组仅注射裸质粒,术前准备,研究内容,手术前1d静脉注射氯化钆， 清除Kupffer细胞,研究内容,图8.动物手术示意图,图9. 动物手术图示，A为解剖肝门部，B为注射 壳聚糖-DNA复合物,研究内容,A,B,研究内容,48h后处死动物，取肝、心、脾、肺、肾组织，作冰冻切片 滴少许甘油碳酸盐缓冲液，放置盖玻片。置于荧光显微镜下，观察绿色荧光蛋白的表达情况,研究内容,实 验 结 果,图10. 肝组织中GF
7、P的表达，可观察到黄绿色荧光 200,A.心,B.肺,D.脾,C.肾,图11. 其他组织无阳性荧光表达 200,壳聚糖（chitosan）的优点,资源丰富 生物可降解性 无免疫原性 靶向性 保护DNA免受DNase的降解,研究内容,讨 论,图12.壳聚糖具有肝靶向性的原理示意图,研究内容,关于壳聚糖在大型动物体内的基因转导，国内外尚无文献报道 壳聚糖通过纳米微囊表面携带的正电荷与细胞膜上携带负电荷的糖蛋白及磷脂的相互作用引发细胞胞吞作用而进入细胞。而且，壳聚糖能包裹、浓缩DNA ，使DNA免受DNase的降解,研究内容,经肝动脉和门静脉注射的给药途径，临床上有可行性 如果用适当的功能基因替换报
8、告基因, 预期相应的基因也可以表达, 并可能达到一定的治疗效果,研究内容,小 结,本实验以壳聚糖与质粒制备成纳米微囊复合体，体外转染7721细胞，结果表明壳聚糖有较高的体外转染效率 体内实验通过肝动脉、门静脉联合给药，在肝检测到较高的绿色荧光蛋白表达水平 首次在大型动物体内完成壳聚糖介导的外源性基因表达,小 结,致 谢,衷心感谢我的导师窦科峰教授在学习生活过程中的照顾和教导 感谢陈勇教授在实验过程中的指导和帮助 感谢肝胆外科各位专家教授和老师们在临床工作中的指导和帮助 感谢新加坡约翰 霍普金斯大学毛海泉教授及其学生对实验的帮助 衷心感谢病理实验室、动物实验中心、肝胆外科实验室的老师、同学们对实验的帮助,致 谢,谢谢,
