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1、TAQ酶简介,酶工程 李爽 15S128041 2015年11月9日,PCR（聚合酶链式反应）,又称“无细胞克隆术”，是一种对特定DNA片段进行体外快速扩增的技术。一改传统的分子克隆技术，数小时内即可扩增107-108倍。 最早发现于1985年美国Cetus公司人类遗传研究室，应用于-珠蛋白基因扩增和镰刀形红细胞贫血症的产前诊断。 随后应用了1976年Chien等人发现的热稳定性DNA聚合酶，使PCR技术大大简化，并使其自动化成为可能。 1987年Kary等人完成了自动化操作装置，使PCR技术进入实用阶段。,TAQ DNA聚合酶,TAQ酶是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Ther
2、mous aquaticus）而得名，简称为TAQ。,TAQ DNA聚合酶,该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。其比活性为200000单位/mg。7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸。温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可保持50%的活性，Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提
3、条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶。此活性温度一般为6568，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.,TAQ的发现,TAQ酶是我国台湾女科学家钱嘉韵分离的，是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的科学家。1973年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对黄石公园温泉中的嗜热菌十分好奇，钱嘉韵因此以该嗜热菌为研究方向，在另一位导师的指导下，钱嘉韵学会了从细胞中分离蛋白质，成功的在嗜热菌中分离出了耐高温的TAQDNA聚合酶。,TAQ的分类,高特异性TAQ酶 高保真TAQ酶 高耐热性TAQ酶 超长片段扩增TAQ酶
4、 关于复杂模版的TAQ酶 关于条件优化的TAQ酶,TAQ的分类,1、高特异性TAQ酶 高度特异性的扩增目的片段是PCR最基本的要求，影响PCR的因素很多，包括模板，引物性质及质量，反应条件的控制等，高特异性的TAQ酶大大地减少了摸条件这一繁琐过程，也为PCR产物快速有效地纯化打下基础。 这类TAQ中最典型的就是热启动TAQ酶。,TAQ的分类,热启动TAQ酶 在 PCR 第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时 Taq 酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特
5、异性条带不能扩出。而热启动是指这种酶的反应温度条件，该酶在90以上才能发挥很好的催化效果，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了 PCR 扩增的特异性。,TAQ的分类,热启动TAQ酶 第一代热启动TAQ酶指的是直接从嗜热菌体内提取的天然聚合酶，直接在其表面进行修饰，如抗体抑制，蜡封等。 为了达到更好的聚合催化效果,往往需要经过酶工程处理，得到的聚合酶催化效率更高，但这些异物的掺入也给实验造成一定影响。 新一代热启动TAQ酶是通过内部改造的重组酶，真正的实现热启动，使用起来方便，高效，稳定。代表产品如QIAGEN公司的的HotStar系列。,TAQ的分类,Hot
6、Star的TAQ HotStar的Taq酶是实现一步法的qPCR的基础。如QIAGEN公司的One step RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶同时激活Taq酶，进行PCR反应。,TAQ的分类,2、高保真TAQ 保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通 Taq 酶的错配率在 10 -5 碱基 / 循环数，而高保真 Taq 酶错配率可降到 10 -6 数量级，大大降低了出错的可能性；它适合对 PCR 保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等等。 高保真 Taq 酶的保真原理:高保真 Taq 酶具有
7、 3 到 5 核酸外切酶的活性。扩增时如出现错配的碱基，可以将其切掉，从而保证扩增的准确性。,TAQ的分类,市面上主要有两类产品： 一类是混合型的高保真酶，将带有 Proofreading 活性的酶与普通 Taq 酶混合起来，可在保真的前提下大大提高扩增效率。错配率在8-910-6碱基/循环数。 另一类是单一型的高保真酶。 QIAGENE公司的ProofStarDNA聚合酶，兼顾特异性与保真性一体，其聚合酶及Proofreading活性都是热启动的，可避免引物降解，错配率达2-410-6碱基/循环数，再加上优化的反应体系可在室温下配置反应液，可进行复杂模板及长片段的扩增。,TAQ的分类,3、高
8、耐热Taq酶 对于有些模板变性温度较高，需要时间较长，可能要求高耐热性 Taq 酶，如 NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA 聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通 Taq 酶耐热性的三倍以上，前者在 95C 半衰期近 7 小时， 100C 近 2 小时；而后者分别为 23 小时和 8 小时。,TAQ的分类,超长片段扩增Taq酶: 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的科研人员，可能会用到超长片段的扩增， Clontech 公司的 Advantage Genomic 系列混有 Tth DNA 聚合酶， Proofreading 酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增 10kb 片段，简单模板可达 40kb 。,Taq酶与PCR技术,关于PCR注意事项,1关于PCR片段延伸时间 产物在1kb以内，延伸时间约1min。3-4kb约需3-4min。 2关于引物 长度一般在18-27bp，不应大于37bp，过长的引物需要高的延伸温度（74），不适于Taq酶的聚合反应。,Thank you！,
