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1、兽医现代监测诊断技术,张 东 四川省动物疫病预防控制中心 研究员,兽医监测诊断技术在动物疫病防控和兽医公共卫生工作中具有重要作用，是预防、控制和扑灭重大动物疫病中的重要一环，为养殖业健康发展和公共卫生安全提供保障。,前言,提纲,面临的复杂形势 动物疫病诊断技术现状 检测技术发展方向与未来展望,1,面临的复杂形势,动物疫病种类多 农业部一、二、三类动物疫病病种名录中列入157种；其中一类17种；二类77种；三类63种。 OIE陆生动物卫生法典2010版中列入94种； 包括多种动物共患病26种；牛病14种； 绵羊和山羊病11种；马病11种；猪病8种；禽病14种； 兔病2种；蜂病6种；其他疫病2种。
2、,新发动物疫病威胁,国外威胁： 非洲猪瘟（俄罗斯）等； 周边省威胁：小反刍兽疫（西藏）、 口蹄疫A型（ 2008年湖北）等； 新发亚型： 口蹄疫亚洲I型（2005年出现）等。,动物疫病病原型别多、变异快,口蹄疫：7个型，多个亚型； 我国O型、亚洲I型（2005年4月传入中国）、A型 流感：A、B、C3个型； A型：H1H16亚型； H5亚型：变异株不断出现 疫苗：-1、-4、-5株 PRRS：1996年美洲型； 2006年变异株； 2009年欧洲型1株。 另外，还有小反刍兽疫（西藏）、疯牛病、非洲猪瘟、尼帕病等外来重大疫病的威胁,2010年列入国家监测计划的动物疫病（16种）,高致病性禽流感、
3、口蹄疫、高致病性蓝耳病、猪瘟 鸡新城疫、布鲁菌病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病 牛海绵状脑病、痒病、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、非洲猪瘟、蓝舌病,国家强制免疫 动物疫病 外来动物疫病,主要疫病的国家指定监测方法,地市级、县级实验室的适用试验技术,县级实验室 地市级实验室,凝集试验（高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟、新城疫等病）； ELISA（猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病等病）,县级实验室开展的试验技术 RT-PCR技术（猪瘟，PRRS 等病）,省内诊断试剂使用的现状,主要诊断试剂 提供单位有： 兰州兽医研究所 哈尔滨兽医研究所,猪瘟和口蹄疫O型正向间接血凝； 口蹄疫型、 AsiaI和 O型液
4、相阻断ELISA； 3ABC-ELISA，VP1-ELISA； 猪圆环病毒ELISA；,禽流感H5血凝抑制抗原； 鸡新城疫血凝抑制抗原；,其他：猪蓝耳病ELISA法国进口； 猪伪狂犬、猪细小病毒ELISA荷兰赛迪诊断公司； 猪蓝耳病RT-PCR，猪乙型脑炎RT-PCR， 猪细小病毒PCR等北京爱德士元亨生物技术有限公司。,疫苗种类各异、诊断试剂和方法多样,以口蹄疫为例 抗体检测试剂品种 病原检测试剂品种,正向间接血凝 琼脂凝胶免疫扩散试剂 液相阻断ELISA试剂盒 非结构蛋白ELISA试剂盒(3ABC) 结构蛋白ELISA试剂盒（VP1） 免疫胶体金试剂盒（测抗体） RT-PCR试剂盒 荧光R
5、T-PCR试剂盒 ELISA试剂盒 免疫胶体金试剂盒（测抗原） 反向间接血凝试剂,国内动物疫病诊断试剂存在的主要问题,技术方法：标准? 各企业生产诊断试剂的的标准不一。 诊断试剂：文号？ 302个产品中，有新兽药证书产品7.6%，有生产批准文号产品4.3%，列入标准产品7%。 法规管理：完善？ 市场秩序混乱：国内生产企业不具有资质、产品无新兽药证书或批准文号、 国外生产企业注册生产的产品进入国内未经注册、非法生产产品 产品质量：不齐？ 1.质量水平低，试验特异性不高，产品保质期短； 2.适用范围窄，操作复杂； 3.生产能力小，购买难； 4.检测目的不明确（型/亚型、感染/免疫抗体等）。,国外动
6、物疫病诊断试剂,进口兽用诊断试剂质量好，但是成本高、购买周期长，有的不适合中国的实际情况。,国内兽用诊断试剂问题之根源,行业特点 产品种类多，成分复杂，生命周期长，技术含量高，质量要求严格，单位用量小 投入资金巨大，产品开发周期长,监管措施不完善,研发：基础研究、高科技研究投入力度小，科研与生产脱节。 生产、经营：企业规模小、效率低、利润低，发展不均衡，且部分没有生产资质；诊断试剂注册审批程序繁琐，进入市场门槛高。 使用：盲目选择诊断试剂，采购、验收、保藏制度不健全。 产业化和商品化发展滞后，非法诊断试剂产品市场占有比例大。,动物疫病诊断试剂行业发展建议,先进的产学研模式，提高自主创新能力，建
7、设科研院所和企业的产业链 严格市场准入 完善的质量监控体系，进行规范化、标准化管理,达到扩充兽用诊断试剂种类，提高产品质量，满足动物疫病监测、诊断工作需要,2,动物疫病诊断技术现状,常用实验室检测技术,组织病理学检测技术 血清学检测技术 分子生物学检测技术 病原学检测技术,组织病理学检测技术,1.病理学检测技术 是利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和病理变化对动物疫病进行诊断。 2.免疫病理学检测技术(免疫组织化学技术) 免疫组织化学方法不仅可在脏器组织中特异地检出病原,又可发挥病理学检测所具有直观、抗原定位准确的特点,还可在脏器组织原位检测出病原（原位PCR）的同时，观察到组织病变与该病
8、原的关系，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程。,血清学检测技术,按其反应性质的不同可分为： 凝集性反应(如凝集试验和沉淀试验) 标记抗体技术(包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体等 特点： 敏感、快速（ELISA 只需要12小时）。 补体参与的反应(补体结合试验、免疫粘附血凝试验等)。 中和试验(病毒中和试验和毒素中和试验) 特点： 时间长，约需要18小时才能获得结果。 免疫转印技术。,正向间接血凝诊断技术,特点：正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，其应用广泛，其无需昂贵的设备，操作简单，并且有快速、敏感、特异性。 操作要点及注意事项： A. 试验准备： 采集3只以上未免疫鸡全血混合制
9、红细胞悬液； 选用孔底应光洁透明无可见沉淀附着物的反应板(一次性的最好)； 待检血清要新鲜，未腐败、溶血，无悬浮物。 B. 操作过程：尽可能的保证样品被全部加入反应孔；每次滴加抗原前应充分摇匀，从稀释度高的孔开始加起，并避免滴头和孔内的液体直接接触；避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。 C. 结果判定： 正确识别“+”的凝集现象。,正向间接血凝反应原理图,间接血凝抑制反应原理示意图,红细胞,联免疫吸附试验（ELISA）,具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、重复性好、安全、适合大批量标准化检测的特点。 是当前应用最广、发展最快的一项新技术，目前该方法已被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。
10、 其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用分光光度计或酶标仪判定结果。 其可分为以下几种方法：,原理及分类,常用的直接法ELISA（测抗体）,分子生物学检测技术,用于动物疫病特异性快速诊断和病原基因变异与进化分析，及时准确掌握动物疫病分子流行病学动态，为疫病防治提供基因理论分析依据。 核酸探针技术、基因序列分析 比如基因芯片试剂盒。 聚合酶链反应（PCR）（应用最广） 疫病的早期诊断和不完整病原的检测 快速、准确、安全的检测病原体 在病原体分类和鉴别中的应用,PCR仪,基因芯片仪,聚合酶链式反应（PCR) 是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过
11、PCR技术获取病原微生物的特异DNA片段，从而为疾病诊断提供重要依据。 特点：快速； 敏感； 步骤较多。,PCR反应原理图,反转录PCR技术,即RT-PCR技术。用于检测RNA病毒。首先提取总RNA，然后加入引物在反转录酶的作用下合成cDNA，加热变性成为单链cDNA后，加入与之互补的另一引物，进行PCR反应。 分为一步法和两步法两种,多重PCR技术(Multi-PCR）,它是一种特殊的PCR形式，其最突出的特点是一次PCR反应在同一反应体系中同时加入多对不同PCR引物和相应的模板，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值。,病原学检测技术,1.细
12、菌的分离与鉴定 2.病毒的分离与鉴定 是病毒性疫病检测、诊断、流行病学调查和未知新病毒进行分类鉴定的重要方法之一。如，此法称为检测口蹄疫的黄金标准。但是对实验室能力要求较高，且耗时长。 3.寄生虫检测 寄生虫病诊断中其定性的实质性方法有以下几种:虫卵检查法、虫体检查法、免疫学检查法和分子生物学检查法。,诊断新技术及应用,我国免疫预防为主的动物防疫政策，决定了在现实的动物疫病监测工作中，迫切需要实用的对动物疫病病原的快速诊断技术以及能区分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断技术。 目前国内符合上述要求的诊断新技术主要有以下3种: 1.免疫胶体金快速诊断试纸条 2. 荧光PCR 3. 鉴别诊断技术 4
13、. 原位PCR技术,免疫胶体金快速诊断试纸条,特点：操作简易，速度快快，10分钟内出结果，方便基层开展工作 目前已经有了口蹄疫、猪瘟、禽流感、血吸虫等病的胶体金快速诊断试纸条。 技术原理：,试纸条的正面和侧面,免疫层析快速检测试纸结构及原理,实时荧光定量PCR,与普通PCR相比： 1. 自动化程度高，极短的检测时间（没有了制胶和PCR产物电泳步骤，快速热循环仪也缩减了运行时间，在30分钟内可以得到完美的实验结果 ）； 2. 敏感性为普通PCR的100倍； 3. 直观的软件分析； 4. 有效解决PCR污染问题； 5. 安全性更好。 6.不足：资金投入大， 检测成本高。,实时荧光定量PCR反应软件
14、分析截图,实时荧光定量PCR仪,鉴别诊断技术,鉴别诊断技术的重要性： A：区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断技术； B：从普遍免疫的动物群体中甄别出自然感染和带毒的动物。 该项技术的核心是基因工程技术、单克隆抗体技术与诊断技术的综合运用，其科技水平高，研究的难度叶较大。 单克隆抗体技术 目前市场上已有部分利用单克隆抗体制备的金标快速检测卡和ELISA试剂盒 （比如猪瘟）。,原位PCR分子病理学新技术,是一种将PCR技术与原位杂交技术结合起来的可以检测组织细胞中微量DNA或RNA且可精确定位的新技术。 特点：敏感度更高，优于免疫组化技术。 目前应用情况：主要用于病毒检测，也有检测组织中寄生
15、虫感染的报道。,3,检测技术发展方向与未来展望,血清学检测技术发展方向,简单、快速便于普及的快速诊断技术 以胶体金标记技术为代表，操作简单、快捷，实现现地现用。 高度集成、自动化的仪器诊断技术 以ELISA（全自动酶免工作站）为代表，可实现大规模操作，且灵敏度高、特异性强。,分子检测技术的发展方向,自动化 利用全自动仪器完成核酸提取、反应液配制、上机反应和结果分析的所有步骤,多功能新型生物液体处理工作站：可以一机实现DNA/ RNA提取和PCR反应建立,实时荧光定量PCR仪：可以一机实现上机反应和结果分析,高通量 在提高灵敏度和特异性的基础上，实现一次检测分析所有常见疫病和对一种疫病分型的目的。 检测和核酸序列分析的综合 随着测序仪器设备的完善，将检测与序列分析结合的诊断技术将逐步应用于临床。,分子检测技术的发展方向,结束语,正确的制定动物疫病监测方案，合理的综合选择实用的诊断技术，可以帮助养殖企业制定科学的动物疫病防治策略和计划，建立有效的净化措施，提高生产质量和经济效益，以保障畜牧业快速、健康、持续发展，保障公共卫生事业，保护人民身体健康。,谢 谢 ！,
