第十三章-生化药物制造工艺-糖类药物

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1、第五节 糖类药物 一、糖类药物概述 糖类是自然界广泛存在的一大类生物活性物质，已发现不少糖类物质及其衍生物具有很高药用价值，有些已在临床广泛应用。 多糖类药物近来很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高机体免疫和抗肿瘤、抗辐射方面都具有显著药理作用与疗效。 随着糖生物学的发展，糖类在生命过程中的重要作用的不断揭示，对糖类药物的研究也越来越受到重视。,（一）糖类药物的分类 糖类药物种类繁多，其分类方法也有多种，按照含有糖基数目不同可分为以下几类。 （1）单糖类：如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。 （2）低聚糖类：如蔗糖、麦芽乳糖、乳果糖等。 （3）多糖类：多糖又有多种，根据其来源不同又可分为：

2、 来源于植物的多糖，如黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖；, 来源于动物的多糖，如肝素、透明质酸、硫酸软骨素等； 来源于微生物的多糖，如香菇多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝糖肽等。 （4）糖的衍生物：如1，6二磷酸果糖、6磷酸葡萄糖、磷酸肌醇等。,（二）多糖的药理活性 多糖具有十分广泛的药理生理作用： 1、抗肿瘤和免疫促进活性 多糖对免疫功能具有重要的调节作用，从多个层次多个途径激活机体免疫系统。包括对各种免疫细胞的调节，对细胞因子的调节以及对补体的调节等。 香菇多糖已用于临床，另外灵芝多糖、地黄多糖、冬虫夏草多糖、海带多糖、微藻多糖等也具有抗肿瘤活性。,2、抗病毒活性 多糖类在结构上与细胞表面糖胺

3、聚糖类似，竞争抑制病毒与细胞结合，同时又是许多细胞表面分子的模拟配体，能直接与细胞结合，阻碍病毒的吸附。 3、抗凝血活性 肝素是天然抗凝剂，带有负电荷。 甲壳素、硫酸化昆布多糖、海带多糖均具有体内外抗凝血作用。芦荟多糖、黑木耳多糖等也具有肝素样的抗凝血作用。,4、抗氧化活性 多糖可通过提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，从而保护生物膜。 5、抗感染作用 多糖可以提高机体组织细胞对细菌、原虫、病毒和真菌感染的抵抗力。如甲壳素对皮下肿胀有治疗作用，对皮肤伤口有愈合作用。 6、降血脂、抗动脉粥样硬化作用 类肝素、硫酸软骨素、小分子量肝素等具有降血脂、降血胆固醇、抗动脉粥样硬化作用，用于防治

4、冠心病和动脉硬化。,7、抗辐射、抗突变 随着人类对多糖研究的不断深入。将会发现多糖更多的作用和用途。,二、糖类药物制备的一般方法 （一）单糖及其衍生物的制备 游离单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇，单糖、双糖类、三糖类、四糖类以及多元醇类 。 可以用水或在中性条件下以50乙醇为提取溶剂，也可以用82乙醇，在7078下回流提取。 植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂，拌加碳酸钙，（药材中拌入碳酸钙或氢氧化钡，以防止酶和有机酸的影响。）以50乙醇温浸，用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离子可通H2S除去，再浓缩。,醇液经活性炭脱色、浓缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。 单糖或小分子寡

5、糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。 （二）多糖的分离与纯化 多糖可来自动物、植物和微生物。来源不同，提取分离方法也不同。 植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。,因温度升高，使多糖受到内源酶的作用。速冻冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。 提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质而定。 酸性黏多糖常含有氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸基等多种结构成分，且常与蛋白质结合在一起，提取分离时，通常先用蛋白酶或浓碱、浓中性盐解离蛋白质与糖的结合键后，用水提取。,1、多糖的提取 提取多糖时，一般需先进行脱脂，以便多糖释放。方法是将材料粉碎，用甲醇或1

6、：1乙醇乙醚混合液，加热搅拌13h，也可用石油醚脱脂。 动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。 多糖的提取方法主要有以下几种。 （1）难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者 对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，可加入硼砂，此法可得相当纯的物质。,（2）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者 材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至8090搅拌提取，提取液用正丁醇与三氯甲烷混合液除去杂蛋白（或用三氯乙酸除杂蛋白），透析后用乙醇沉淀得多糖。 （3）黏多糖 因大部分黏多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解法或碱解法使糖蛋白质间的结合键断裂，促使多糖释放。 碱解法可以防止黏多糖分子中硫酸基的水解破坏，也可以同

7、时用酶解法处理组织。,碱解法。多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。 黏多糖分子上的硫酸基一般对碱较稳定，但若硫酸基与邻羟基处于反式结构或硫酸基在C 3或C 6上，此时易发生脱硫作用。因此对这类多糖不宜用碱解法提取。 酶解法。蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。 鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因此成品中会保留较长的肽段。为除去长肽段，常可与碱解法合用。,2、多糖的纯化 多糖的纯化方法很多，但必须根据目的物的性质及条件选择合适的纯化方法。一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。 （1）乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是制备黏多糖

8、的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。如使用充分过量的乙醇，黏多糖浓度少于01也可以沉淀完全。 向溶液中加入一定浓度的盐，如醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或氯化钠有助于使黏多糖从溶液中析出，盐的最终浓度5即足够。使用醋酸盐的优点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇过量时，也不会发生这类盐的共沉淀。,加完乙醇，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状产品。 （2）分级沉淀法 不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子量大小不同的黏多糖。 在Ca2、Zn2十等二价金属离子的存在下，采用

9、乙醇分级分离黏多糖可以获得最佳效果。,（3）季铵盐络合法 黏多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基氯化吡啶（CPC）等能形成季铵盐络合物。 这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离、溶解、释放。 无机盐浓度（临界盐浓度）主要取决于聚阴离子的电荷密度。黏多糖的硫酸化程度影响其电荷密度。 季胺盐的沉淀能力受其烷基链中的亚甲基数的影响，还可以用不同种季铵盐的混合物作为酸性黏多糖的分离沉淀剂。 应用季铵盐沉淀多糖是分级分离复杂黏多糖的最有用方法之一。,（4）离子交换层析法 黏多糖由于具有酸性基团如糖醛酸和各种硫酸基，在溶液中以聚阴离子形式存在，因而

10、可用阴离子交换剂进行交换吸附。 洗脱时可以逐步提高盐浓度如梯度洗脱或分步阶段洗脱。 （5）凝胶过滤法 凝胶过滤法可根据多糖分子量大小不同进行分离。 此外，区带电泳法、超滤法及金属络合法等在多糖的分离纯化中也常采用。,3、溶液中多糖浓度的测定 （1）蒽酮硫酸比色法测定糖含量 糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂结合产生颜色反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。 标准曲线：以“0”管作空白对照， 620nm处的吸光度，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。 取样品液0.1ml，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。,（2）3，5二硝基水

11、杨酸（DNS）比色法测定还原糖 在碱性溶液中，DNS与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 （3）苯酚硫酸比色法 苯酚硫酸试剂可与多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。,（4）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖 葡萄糖氧化酶专一氧化葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢，再利用过氧化物酶催化过氧化氢氧化某些物质如邻甲氧苯胺使其从无色转变为有色，通过比色法计算葡萄糖含量。 葡萄糖溶液中葡萄糖和葡萄糖存在着动态平衡，随着葡萄糖的氧化，最终所有型全部转变成型被氧化。 （5）Nelson法

12、 还原糖将铜试剂还原生成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560nm下的吸收值与糖含量呈线性关系。,4、纯度检查 多糖的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均分布，通常所说的多糖纯品也是指具有一定分子量范围的均一组分。 多糖纯度的鉴定通常有以下几种方法： （1）常压凝胶层析法 凝胶层析法是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性来进行的。 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的保证。,（2）高效凝胶渗透色谱法 HPLC法具有快速、高分辨率和重现性好的优点，因此得到越来越多的应用。 用于HPLC的凝胶柱均为商品柱，其填料有疏水性的，也有亲水性的，而且每根柱的孔径不同，分离分

13、子量的范围亦不同。 选用哪一种性质的填料和用多大的排阻限和渗透限，主要取决于被分离溶质的性质和可能的分子量大小。 多糖的检测不采用柱后衍生化方法，而是采用直接检测。,（3）比旋度法 不同的多糖具有不同的比旋度，在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度。 如果多糖的水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉淀具有相同比旋度，则该多糖为均一组分。 （4）超离心法 如果多糖在离心力场作用下形成单一区带，说明多糖微粒沉降速度相同，表明其分子的密度、大小和形状相似。,三、重要糖类药物的制备 糖类药物品种繁多，现根据其来源、性质及工艺特点不同，主要介绍具有代表性的几个重要品种的生产工艺。 （二）1，6-二磷酸果糖 （1)

14、、结构与性质 1，6-二磷酸果糖是果糖的1，6-二磷酸酯，其分子形式有游离酸FDPH4与钠盐如1，6-二磷酸果糖三钠盐（FDPNa3H）等。 FDPNa3H为白色晶形粉末，有旋光，易溶于水，不溶于有机溶剂。,2、生产工艺 1）酶转化工艺 （1）工艺路线：,取经多代发酵应用过的酵母渣，悬浮于适量蒸馏水中，反复冻融3次，加入底物（8蔗糖，4NaH2PO4，30mmolL MgCl2，pH6.5）于30，反应6h。 除杂蛋白 煮沸5min。 阴离子交换柱层析 转酸 FDPCa沉淀悬浮于水中，732树脂转酸，NaOH调pH535.8，除菌过滤后，冻干。,（三）肝素 1、结构与性质 肝素是天然抗凝剂，是

15、一种含有硫酸基的酸性粘多糖。 肝素及其钠盐为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂，其游离酸在乙醚中有一定溶解性。 肝素分子中含有硫酸基与羧基，呈强酸性，为聚阴离子，能与阳离子反应成盐。 硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝活性。小分子量肝素（分子量40005000）具有较低的抗凝活性和较高的抗血栓形成活性。,2、生产工艺 肝素系广泛分布于哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液里。 其生产工艺主要有盐解-季胺盐沉淀法，盐解-离子交换法和酶解-离子交换法。肝素在组织内和其他粘多糖一起与蛋白质结合成复合物，因此肝素制备过程包括肝素蛋白

16、质复合物的提取、解离和肝素的分离纯化两个步骤。,1）盐解-离子交换生产工艺 （1）工艺路线：,继续升温至95，维持10min 。 95乙醇沉淀过夜 NaOH调PH11 ，按3量加入H2O2（H2O2浓度30），共48小时 。去热原、杂质。,3、检验方法 4、作用与用途 肝素是典型的抗凝血药，能阻止血液的凝结过程，用于防止血栓的形成。,（四）小分子肝素 1、结构与性质 肝素通过与AT结合并抑制a因子和Xa因子活性而发挥抗栓、抗凝作用。,（2）工艺过程 降解。 HCl调pH至2.8，加NaNO2反应，反应温度为1825，用KI试纸控制终点。 还原。调节pH至9.8，反应温度为1825，加NaBH4反应2h。 沉淀。调节pH至5.56.6，95乙醇沉淀，得小分子肝素粗品。蒸馏水溶解，95乙醇沉淀。蒸馏水溶解，95乙醇沉淀。得小分子肝素精品。,3、检验方法 抗Xa因子活性测定 抗II a因子活性测定 4、作用和用途 小分子量肝素钠具有抗Xa因