《gst标签的去除.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《gst标签的去除.doc（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、GST标签的去除GST标签的去除可在目的蛋白的功能或结构研究之前进行。根据目的蛋白的性质不同，完全消化所需的蛋白酶量、温度、及孵育长度也各异。含有PreScission蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点的标签蛋白可在与Glutathione Sepharose层析填料结合时切割，或者洗脱后在溶液中切割。当GST蛋白与柱结合时，切割释放了目的蛋白，它与结合缓冲液一起洗脱，而GST部分仍与填料结合。一般来说，柱上切割是推荐使用的方法，因为许多潜在的杂质都能洗掉，目的蛋白在洗脱时具有更高的纯度。如果需要优化切割条件，建议洗脱后切割。从蛋白或肽段制备中去除丝氨酸蛋白酶如凝血酶、Xa因子和PreSciss
2、ion蛋白酶，可利用Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow来进行，此填料有大包装。为了方便，Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow也有预填充的HiTrap Benzamidine FF 1 ml和 5 ml柱。凝血酶凝血酶能够对带有可接近的凝血酶识别序列的融合蛋白进行位点特异的切割，用于消化包含凝血酶识别序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-1T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2及pGEX-4T-3）。在22C，1PBS中，一个单位的酶16小时可切割100 g待测GST标签蛋白，切割效
3、率在90%以上。Xa因子纯化自牛血浆的Xa因子特异切割四肽Ile-Glu-Gly-Arg之后的蛋白，可用于消化包含此序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3）。在22C，1 mM CaCl2、100 mM NaCl和50 mM Tris-HCl（pH 8.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 g待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。PreScission蛋白酶PreScission蛋白酶是一种遗传改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C蛋白酶和GST组成。这种蛋白酶是专为蛋白酶的去除而设计，能实现同时的蛋白酶固
4、定和pGEX-6P载体（pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3）所产生的GST融合蛋白的切割。PreScission蛋白酶特异切割Glu和Gly残基之间的识别序列LeuGluValLeuPheGlnGlyPro。蛋白酶在4C具有最大活性，因此切割在低温下进行，改善了目的蛋白的稳定性。在5C，50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（pH 7.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 g待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。GST标签蛋白可通过亲和层析，利用固定在基质上的谷胱甘肽从例如细菌裂解液中轻松纯化。GST
5、与谷胱甘肽之间的高特异性确保了单个步骤就能获得高纯度。洗脱在温和、非变性的条件下进行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。通用电气医疗集团现有多种亲和纯化产品。Glutathione Sepharose填料（表1）也有多种形式，从预填充的MultiTrap 96孔过滤板到预装柱的SpinTrap、GraviTrap、HiTrap及HiPrep柱，或实验室包装（填料包装的体积从25 ml到500 ml）。不同的形式提供了从微克到克规模的样品的纯化选择。 表1. Glutathione Sepharose填料的特征1 每毫升填料结合的重组谷胱甘肽硫转移酶。GST蛋白的结合取决于上样样品中蛋白的大小、构象
6、和浓度。GST与谷胱甘肽的结合也是流速依赖的，低流速通常会提高结合能力。这对于上样过程很重要。蛋白性质、pH和温度，以及使用过的填料也会影响结合能力。2 室温下的水。仪器的选择将取决于特定的纯化。在利用微型离心柱时洗脱在台式离心机中进行，或利用重力流柱手动进行，或利用蠕动泵或注射器再加上预填充的GSTrap柱进行分步梯度洗脱。GST MultiTrap 96孔板是为小体积的高通量筛选而设计的，每孔能纯化多达500 g GST标签蛋白。每根GST SpinTrap柱能纯化多达500 g蛋白。对于更大量的纯化，预装柱如GST GraviTrap、GSTrap和GSTPrep 16/10则提供了卓越
7、的形式。GST SpinTrap柱GST SpinTrap 柱非常适合放大之前的表达水平及纯化条件的筛选。柱的设计可用于微型离心机。每根柱子含有50 l Glutathione Sepharose 4B，足够纯化最多500 g重组GST。柱子在含有0.05% Kathon（一种抗菌的防腐剂）的1PBS缓冲液中经过了预平衡。每个包装含有50根柱子。随机选择大肠杆菌转化物，这些转化物中含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA，之后表达，并用GST SpinTrap柱进行纯化。人肌红蛋白的cDNA与线性化的pGEX-5X-1连接，并转化大肠杆菌BL21细胞。24个随机选择的克隆接种到3 ml 培养
8、基中，过夜培养。用IPTG诱导表达2小时。取每个培养物1.5 ml，通过反复冻融步骤制备裂解液，再上样到GST SpinTrap柱中。取每种还原型谷胱甘肽洗脱液的等份，上样到SDS凝胶中，用于SDS-PAGE的分析（图1）。结果显示，24个转化物中的7个表达了带GST标签的肌红蛋白。图1. 筛选24个随机选择的含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA的大肠杆菌转化物，将洗脱液进行SDS-PAGE分析。M = LMW-SDS Marker Kit。1-24泳道含有利用还原型谷胱甘肽从GST SpinTrap柱上洗脱下来的产物。GST GraviTrap柱GST GraviTrap是方便的一次性
9、柱子，其中预装了2 ml Glutathione Sepharose 4B，足够纯化最多20 mg GST标签蛋白。每个包装含有10根预装柱，是由生物兼容的聚丙烯制造的。特殊的釉料保护填料在纯化过程中不会变干。GST GraviTrap柱在送达时的包装可便利地转化成柱子支架（Workmate）。产品包装中的塑料托盘可用于收集废液。当处理体积超过10 ml时，将Labmate PD-10 Buffer Reservoir与柱子连接，能将上样量增加至大约35 ml。GST Bulk试剂盒GST Bulk试剂盒含有10 ml大包装的Glutathione Sepharose 4B和5根一次性的柱子。
10、有了这个试剂盒，GST标签蛋白可利用柱层析或分批法进行纯化。GST Bulk试剂盒含有足够的试剂，能纯化最多50 mg GST标签蛋白。GST MultiTrap 96孔过滤板GST MultiTrap 96孔过滤板目前有两种选择：GST MultiTrap FF和GST MultiTrap 4B，分别预装了Glutathione Sepharose 4 Fast Flow和Glutathione Sepharose 4B。两种产品都能提供高重复性、高通量的筛选，从不澄清或澄清的样品中小规模快速纯化GST标签蛋白。典型的应用包括不同重组子的表达筛选，蛋白可溶性的筛选，以及小规模平行纯化条件的优
11、化。利用GST MultiTrap可直接从不澄清的细胞裂解液中纯化最多500 g GST标签蛋白/孔，缩短了操作时间，将敏感目的蛋白的降解降至最低。96孔板形式具有很大的灵活性，可与自动化的机器人系统共同使用，也可通过离心或抽真空手工操作。孔与孔之见、板与板之间的一致性能确保了高重复性。利用GST MultiTrap FF来设计缓冲液筛选研究，确定纯化GST-海马钙结合蛋白的最佳缓冲液条件。检测的参数有缓冲液、pH、氯化钠、甘油、DTT和谷胱甘肽。同时还进行了超声破碎与市售细胞裂解试剂盒的使用效果比较。利用MODDE软件（Umetrics）来进行因子设计（实验设计）和统计分析。不同缓冲液条件和
12、样品制备方法随机应用到过滤板中。样品、结合缓冲液或洗涤缓冲液中谷胱甘肽的存在显著降低了纯化的GST-海马钙结合蛋白的产量，而缓冲液对产量无影响。低pH改善了产量，而pH和添加剂如DTT、甘油或氯化钠未显著影响纯度（图2）。筛选结果表明，对于GST-海马钙结合蛋白的纯化，获得最高产量和纯度的缓冲液条件是介于10到20 mM的磷酸钠，140到400 mM的NaCl，pH 6.2-7.4。样品制备可通过市售的细胞裂解试剂盒及超声破碎来进行，不会显著影响纯化结果。图2. 将GST MultiTrap FF过滤板的一些孔中收集而来的GST-海马钙结合蛋白的洗脱组分进行SDS-PAGE（还原条件，Exce
13、lGel SDS Gradient 818；考马斯蓝染色）。GST缓冲液试剂盒GST缓冲液试剂盒含有纯化GST标签蛋白所使用的结合及洗脱缓冲液的储备溶液。试剂盒省去了耗时的缓冲液制备，促进了快速、便利且重现性好的纯化工作。足够的试剂可纯化最多20 mg GST标签蛋白。GST缓冲液试剂盒含有10PBS，还原型谷胱甘肽、稀释缓冲液和操作指南小册子。蛋白纯化的放大纯化过程可轻松放大；Glutathione Sepharose 4 Fast Flow、Glutathione Sepharose 4B 及 Glutathione Sepharose High Performance都有更大的预装柱，以
14、及大包装的填料。推荐增加第二步的凝胶过滤步骤，来精炼目的蛋白，去除可能的聚集物。GSTrap亲和柱是1 ml和5 ml的HiTrap预装柱，能纯化毫克级的GST标签蛋白。GSTrap柱填充有三种不同的Glutathione Sepharose填料GSTrap FF、GSTrap 4B和GSTrap HP。利用注射器及提供的连接器，蠕动泵或液相色谱系统如KTA design，可进行样品上样、洗涤和洗脱。GSTprep FF 16/20是预装了Glutathione Sepharose 4 Fast Flow的20 ml Hiprep柱，可用于毫克至克规模的GST标签蛋白的纯化。来自通用电气医疗集
15、团（GE Healthcare）的谷胱甘肽硫转移酶（GST）基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的GST标签蛋白的多功能系统。系统包括三个主要成分：pGEX质粒表达载体、GST纯化的产品以及一系列GST检测产品。一系列切割GST标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。GST亲和标签实现了温和的纯化过程，不会影响蛋白的天然结构和功能。GST基因融合系统的优势包括： 所有pGEX载体带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白基于Glutathione Sepharose填料的亲和层析产品实现了从微克到克规模样品的一步纯化方便的预装柱形式适合单个样
16、品或平行筛选多个重组克隆pGEX载体上的PreScission 蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来利用抗-GST抗体轻松检测融合蛋白在天然情况下，GST以分子量26,000的蛋白存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。经过鉴定，pGEX载体的重组日本血吸虫（Schistosoma japonicum）GST的晶体结构与天然蛋白一致。pGEX质粒载体将基因或基因片段与GST融合后，在细胞内高水平诱导表达。重组蛋白很容易利用Glutathione Sepharose填料通过亲和层析从比如大肠杆菌细胞裂解液中纯化（图1），要么是预装柱，要么是分批纯化。图1. Glutathione Sepharose High Performance、Glutathione Seph
