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1、病毒的接种,新乡医学院微生物学教研室,实验目的,了解 病毒的培养方法 掌握 病毒的鸡胚绒毛尿囊膜接种法及小鼠脑内接种方法。,概述,病毒结构简单，缺乏完整的酶系统，不能在无生命的人工培养基中生长，必须在活的组织细胞中才能增殖。,动物接种法 鸡胚培养法 组织细胞培养法,常用的分离、培养、鉴定病毒的方法,动物接种,动物接种（Animal inoculation）是最早应用的病毒培养法，在病毒学研究中主要有三方面用途：分离鉴定病毒、通过传代增殖或减弱病毒毒力、制备免疫血清。在分离病毒时由于动物自身可能带有病毒，而且许多病毒没有敏感动物，因而目前多被组织培养所代替。 常用的动物有小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、
2、家兔、羊和猴等。接种的途径有鼻内、皮内、脑内、腹腔内和静脉注射等。,小鼠脑内接种,1、以无菌0.25ml注射器抽取流行性乙型脑炎病毒悬液0.1ml，去除注射器内的气泡。 2、取出小鼠，左手将小鼠固定（固定时用大拇指和食指握住小鼠的头部，左手手掌轻轻按住小鼠的体部）。 3、右手用棉签蘸以碘酒，消毒小鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。,4、右手拿注射器在小鼠颞部（眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向）注入，进入颅腔即可（一般进针23mm），不要插得太深，注射量为0.020.03ml。 5、注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。,鸡胚接种,
3、接种途径 可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离流感病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法,尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 绒毛尿囊膜接种法 羊膜囊接种法,气 室,鸡 胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵 白,卵膜,判断鸡胚是否存活, 在检卵灯下观察能否看到清晰的血管； 胚胎是否移动； 若胚龄过长，则需观察其胎盘部分，胎盘部分变苍白说明胚胎死亡，正常时胎盘发暗，蛋白部分透亮。,绒毛尿囊膜接种法,定位：将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出，在胎盘与蛋白交界处（无血管区）画一直径约1cm的等边三角形。,卵窗,气 室,鸡 胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵 白,卵膜,
4、取卵壳：消毒后取下所画三角形区域的卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要伤及绒毛尿囊膜）， 造人工气室：在自然气室部分用大注射器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一“人工气室”,接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒0.10.2ml。 封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。 培养：放入温箱培育4天，然后收获病毒。,真菌菌落的观察（示教）,真菌培养营养要求不高，在一般培养基上能生长 常用沙保弱（Sabouraud）培养基（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、琼脂），真菌的最适酸碱度是pH4.06.0，最适生长温度浅部真菌2228，深部真菌
5、37 。,真菌菌落类型,酵母型菌落（yeast colony） 菌落光滑、湿润。无菌丝 隐球菌菌落 类酵母型菌落（yeast-like colony） 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 丝状型菌落（filamentous colony） 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落,新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，与一般细菌菌落相似。 白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培养基内。,絮状表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，呈草绿色，且培养基常有皱裂。 石膏样小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。,注意事项,消毒小白鼠时不要碰到眼睛 注射时不要扎的太深以免刺伤对侧手指 磨卵壳及钻孔时力量要适中 看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中,
