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1、聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction),PCR 是利用热稳定 DNA 聚合酶在体外快速扩增 (复制) 某一特定 DNA 片段的方法。,PCR 原理,1983 发明 PCR 技术; 1993 获得诺贝尔化学奖,Kary B. Mullis,美国 Yellowstone 公园的热泉,嗜热水生细菌 (Thermus aquaticus),Taq DNA 聚合酶 3D结构,PCR 过程,1. 模板变性 (Denaturation) 双链 DNA 模板在 95C 变性为单链 DNA。 2. 引物退火 (Annealing) 引物与单链 DNA 互补并退火。 3. 延伸反应
2、 (Extention) 热稳定 DNA 聚合酶催化子链的合成。,缓冲液 (Tris-HCl, KCl) MgCl2 或 MgSO4 DNA 模板 上游引物 (upstream primer, sense primer) 下游引物 (downstream primer, antisense primer) 底物 dNTPs 热稳定 DNA 聚合酶,PCR 反应体系,1. 长度： 18 - 24 个核苷酸； 2. GC ：40 - 60；,引物设计的原则,引物长度为 18 - 24 个碱基： Tm (C) 4 (GC) 2 (AT) 5 ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3 GC 12；
3、AT 8 Tm 4 X 12 2 X 8 64C,3. 四种碱基随机分布；,4. 引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；,5 GTTGACTTGATA T 3 GAACTCT,5 GTTGACTTGATATTCTCAAG 3,引物的自身互补序列形成发夹结构,5 ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3,3 TGCTTAAGCACCGATGGCCA 5,5 ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3,两个引物分子形成二聚体,5. 引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体 (dimer)；,6. 引物的 5 端可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向克隆。,5 CATATG,
4、3,3,TTCGAA 5,NdeI,HindIII,常用的热稳定 DNA 聚合酶,待扩增片段：1000 bp 引物 Tm 55 DNA 模板变性: 94, 5分钟; PCR 循环 (30 次): 94, 30秒; 50, 30秒; 72, 1分钟; 最终延伸: 72, 7-10分钟,PCR 反应条件的设定,PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳,PCR 产物,PCR 产物,逆转录酶以 mRNA 为模板合成第 1 条 cDNA 链，然后通过 PCR 反应扩增出许多 cDNA 分子拷贝。用于 检测某一基因在转录水平的表达及克隆特异的 cDNA,RT-PCR,一步法 RT-PCR RT 反应与 PCR
5、 反应在同一个试管中进行。 两步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在不同的试管中进行。,下游引物 特异性引物 Oligo(dT),-actin GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 18S rRNA,用作内参的管家基因,Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR 在 PCR 反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号的积累实时监测 PCR 反应进程，对扩增的 PCR 产物进行定量分析的方法。 具有高度敏感性：用于检测微量的 DNA 或 RNA 样品； 检测每一次 PCR 循环中产物的积累； 扩增反应
6、结束后不需要对PCR 产物进行电泳。,1. 基础研究 (1) 基因克隆：从核酸数据库中获得特定基因的核苷酸序列，设计引物。 (2) cDNA 克隆：从核酸数据库中获得特定 cDNA (mRNA) 的核苷酸序列， 设计引物。 (3) 基因定向突变 (Site-specific mutagenesis )：引物含有突变的碱基。 (4) 基因表达：用 RT-PCR 或 qRT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。 2. 医学 (1) 感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。 (2) 遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。 (3) 恶性肿瘤的诊断 3. 基因动、植物的检测
7、 (1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 (2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。,PCR 技术的应用,正常人血红蛋白 亚基,镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基,镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基编码基因,正常人血红蛋白 亚基编码基因,PCR DdeI 酶切 琼脂糖凝胶电泳,核酸分子杂交 (Hybridization of nucleic acids),核酸分子杂交 两条互补的 DNA 单链或一条 DNA 单链与其互补的 RNA 链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交通常是指探针与受体 DNA 或 RNA 分子的之间的杂交。 探针 (probe) 用同位素或非同位素标记的序
8、列已知的核苷酸链 (单链 DNA 或 RNA 分子) 称为探针。 探针用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。,核酸分子杂交类型及特点,转膜 (印迹),琼脂糖凝胶电泳,制备受体 DNA/RNA,洗膜,检测探针,制备探针,预杂交,杂交,一、探针的标记 1. 同位素标记的探针 常用的同位素为 32P、35S 2. 非同位素标记的探针 高度灵敏感; 便于检测 利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明 (rhodamine) 等检测杂交的探针; 探针稳定，并且可被反复使用多次； 不会危害操作者的健康并且不污染环境； 常用的非同位素标记 地高辛 (Digoxigenin, DIG) 生物素 (Biotin
9、),3DIG 标记探针的方法,二、DNA/RNA 样品的制备及电泳 1. DNA 样品 制备基因组 DNA; 限制性内切酶酶切基因组 DNA; 用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组 DNA 2. RNA 样品 制备总 RNA; 用变性琼脂糖凝胶电泳分离 RNA,三、DNA/RNA 从凝胶向膜的转移 - 印迹 (blotting) 转移方法 毛细管转移 (Capillary transfer) 在缓冲液中，DNA 或 RNA 从凝胶中被动地转移到膜上。 真空转移 (Vacuum blotting) 电转移 (Electroblotting) 电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。,膜支持物 尼龙膜
10、 (Nylon membrane) 硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose membrane),毛细管转移,四、将 DNA/RNA 固定在膜上的方法 1. 干烤 置尼龙膜于抽真空的 120C 烤箱中 2 小时； 置硝酸纤维素膜于抽真空的 80C 烤箱中 2 小时。 2. UV 交联作用 用 UV 将 DNA/RNA 固定在尼龙膜上。,UV 交联仪 (UV Crosslinker),五、DIG 探针与靶分子的杂交 1. 探针 杂交前用热变性方法将双链 DNA 探针变性为单链 DNA 探针。 2. 杂交条件 保证探针与靶分子特异杂交。,3. 洗膜 使探针与非特异杂交的序列分离。,探针与靶分子
11、的杂交,六、DIG 探针的检测 1. 在抗 DIG 抗体上偶联荧光素 用于原位杂交 2. 在抗 DIG 抗体上偶联碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催 化的底物显色反应或化学发光反应检测 DIG 探针信 号。 用于显色反应的底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 用于化学发光反应的底物 CSPD 和 CDP-Star,用碱性磷酸酶检测 DIG 探针,显色反应的底物：NBT, BCIP 化学发光反应的底物：CSPD, CDP-Star,化学发光反应,显色反应,Southern 印迹,将变性的 DNA 分子 (单链) 转印到尼龙膜上,琼脂糖凝胶电泳分离酶切的 DNA
12、片段,用限制性内切酶酶切基因组 DNA,预杂交：降低探针与膜结合的机会 杂交：探针与靶分子杂交 洗膜：洗去非特异结合探针,检测探针,DNA 芯片 (DNA Chip) 技术,DNA 芯片技术是一种大规模集成的固相杂交。 在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的 DNA 探针有序地固化于支持物表面，然后与标记的 DNA 或 RNA 样品杂交。 通过检测杂交信号来分析样品的基因序列或表达信息。,Arrayer,Hybridization Oven,Array Scanner,正常细胞,mRNA,cDNA,(红色荧光染料标记的 cDNA),异常细胞,mRNA,cDNA,(绿色荧光染料标
13、记的 cDNA),与芯片杂交,只在正常细胞中表达的基因,只在异常细胞中表达的基因,在正常细胞在异常细胞中等量表达的基因,在正常细胞中高表达的基因,在异常细胞中高表达的基因,在正常细胞在异常细胞中都不表达的基因,DNA 序列测定 (DNA sequencing),2, 3-ddNTP,双脱氧链终止法 (Sanger 法): 在 DNA 聚合酶的催化下，2, 3-ddNTP 底物通过其 5 -P 基团掺入到延伸的 DNA 链中；由于缺少 3 -OH，后续 dNTP 不能与其形成磷酸二酯键，导致 DNA 链的合成终止。,DNA 测序方法,DNA 测序过程 1) 退火反应: 使待测 DNA 模板热变性
14、为单链 DNA，与测序引物发生退火。 2) 标记反应: 单链 DNA 模板-引物、dNTP、-35SdATP 和测序酶 (DNA 聚合酶)。 3) 终止反应: 将标记反应混合物分成四组，分别加入含有 ddATP、ddTTP、ddCTP 和 ddGTP 的终止反应液。 4) 电泳: 用变性聚丙烯酰胺凝胶分离新合成的 DNA 片段。 5) 放射自显影: 根据 X-光胶片上条带的位置，读出新合成 DNA 片段的核苷酸顺序，从而得知待测 DNA 链的核苷酸顺序。,3- CGTAACGTACCGATCGTCGTACTAGACA - 5,3- CGTAACGTTCCGATCGTCGTACTAGACA -
15、5 5- GCATTGCA 3,退火反应,“A”反应 DNA 聚合酶 dNTP ddATP,“T”反应 DNA聚合酶 dNTP ddTTP,“G”反应 DNA聚合酶 dNTP ddGTP,“C”反应 DNA聚合酶 dNTP ddCTP,标记反应及终止反应,测序引物结合位点,待测序 DNA 链,“A”反应 5A 3 5AGGCTA 3 5AGGCTAGCA 3 5AGGCTAGCAGCA 3 5AGGCTAGCAGCATGA 3,“G”反应 5AG 3 5AGG 3 5AGGCTAG3 5AGGCTAGCAG 3 5AGGCTAGCAGCATG 3 5AGGCTAGCAGCATGATCTG 3,“T”反应 5AGGCT 3 5AGGCTAGCAGCAT 3 5AGGCTAGCAGCATGAT 3 5AGGCTAGCAGCATGATCT 3 5AGGCTAGCAGCATGATCTGT 3,“C”反应 5AGGC 3 5AGGCTAGC 3 5AGGCTAGCAGC 3 5AGGCTAGCAGCATGATC 3, 测序引物,测序反应所产生的系列单链 DNA 片段始于测序引物结合位点并终止于 ddNTP。,5 AGGCTAGCAGCATGATCTGT 3 5 AGGCTAGCAGCATGATCTG
