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1、洁净环境验证 主讲：柴海毅 ,洁净环境控制的两个主要方面：,1、尘埃粒子 2、微生物,洁净室环境监测主要方面：,1、尘埃粒子监测,洁净级别的划分：,中国2010GMP洁净级别的划分和欧盟GMP基本一致。 FDA Guidance for Industry ISO 14644,洁净级别对比：,GMP （2010年版）附件1,医药工业洁净室最大允许空气悬浮粒子数 (个/立方米),尘埃粒子测试依据：,现状： 采用GB/T16292-2010 医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法 GMP 2010年版 测试方法可参照ISO14644-1,测试状态：,静态 动态,采样点位置要求：,采样点数目要求：,I
2、SO14644的规定，采样点数洁净室面积,采样量的要求：,1、采样量要足够大，保证能检测出至少20个 粒子； 2、每个采样点每次的采样量至少为2升； 3、采样时间最少为1分钟。,采样量的对比：,采样量计算方法：,依据：ISO14644-1 最小采气量（立方米） 20（个）某直径粒子的限度 标准（个/立方米）,例如： A级区5m粒子的标准是：20个/M3 A级区最小采气量20个20个/ M3 1 M3 B级区5m粒子的标准是：29个/ M3 B级区最小采气量20个29个/ M3 0.69 M3 690L C级区5m粒子的标准是:2900个/ M3 C级区最小采气量20个2900个/ M3 0.0
3、069 M3 6.9L D级区5m粒子的标准是29000个/ M3 D级区最小采气量20个29000个/ M3 0.00069 M3 0.69L,尘埃粒子计数器的选择：,A级区、B级区测试： （1）如果采用2.83升/分钟的检测仪器，每次采样的 时间过长了（1000L2.83L/分钟350分钟）。 （2）如果选用28.3L/分钟的，每次采样需35分钟， 对于面积小、采样点少的洁净区，是可以符合 要求。（1000L28.3L/分钟35分钟）。 所以要选择大流量的尘埃粒子计数器。,尘埃粒子计数器的选择：,C级、D级区测试时： 最小采气量大于6.9升即可，此时选择传统的2.83升/分钟的检测仪器就能
4、达到要求，每次采样的时间不超过3分钟而已。 （6.9L2.83L/分钟2.44分钟）。 如果只测试C级、D级区，选择普通小流量的粒子计数器就满足要求。,新要求：尘埃粒子在线监测,尘埃粒子在线监测：等动力取样,洁净室环境监测主要方面：,2、微生物监测,洁净区微生物监测的动态标准 （GMP2010版）,微生物测试依据：,GMP2010年版 & EU GMP GB/T 16293-2010 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法 GB/T 16293-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法 USP ISO14644 无微生物限度的标准,欧盟GMP 附录1. (2003) 医药工业洁净室建议最大
5、允许的微生物含量,USP29 医药工业洁净室建议最大允许的 微生物含量(动态),洁净室微生物监测的三个方面：,第一、浮游菌 第二、沉降菌 第三、表面微生物,环境微生物控制和评估原则：,环境监测取样点的设置：,应该考虑但不局限于以下因素： 该点最易受微生物污染，很有可能对产品质量造成不良影响 该点在实际生产中微生物便于微生物繁殖 统计学上的要求 该点不易清洁、消毒 房间的洁净度级别 可能污染产品的采样点,采样点示例：,浮游菌监测：,采样点的位置,浮游菌监测,最小采样量,沉降菌监测,采样点的位置 a) 工作区采样点位置离地0.8m1.5m左右（略高于工作面） b) 可在关键设备或关键工作活动范围处
6、增加测点。,沉降菌监测,最小培养皿数,沉降菌测试时间,沉降平皿的暴露时间不少于4小时； 如果同一位置使用多个沉降平皿进行监测并累计计数，单个沉降平皿的暴露时间可以少于4小时。,表面微生物监测,包括： 设备表面 墙面 地面 洁净服表面,表面微生物取样点设置,控制微生物污染的途径：,1、有效地阻止室外的污染侵入室内。 2、迅速有效地排除室内已发生的污染。 3、控制污染源，减少污染发生量。,防止和消除微生物污染的措施：,压差,压差的监测,风速,层流与高效的比较：,例如：HEPA送风口面积为1m2，送风的风速为0.45m/s， 层流到工作面的距离为0.02m；高效到工作面得距 离为2m。 每小时送风量
7、相当的换气次数： 层流换气：0.45m/s X 3600s X 1m2 = 1620 m3 1620 m3/ (1m2 X 0.02m) = 81000次/小时 高效换气：0.45m/s X 3600s X 1m2 = 1620 m3 1620 m3/ (1m2 X 2m) = 810次/小时 相同级别下，层流与高效相差100倍。,环境监测频率：,环境监测频率：,环境控制计划和实施：,环境控制计划和实施：,环境监测培养基的选择,微生物总数,细菌数：在细菌培养基上菌落形成单位的平均数。 真菌数：在真菌培养基上菌落形成单位的平均数。 微生物总数 = 细菌数 + 真菌数,细菌、真菌培养基：,GB/T
8、 16293-2010 GB/T 16294-2010,采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30 35 培养箱中培养，时间不少于2d； 采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20 25 培养箱中培养，时间不少于5d。,微生物计数的困惑 ！,细菌培养基上生长的真菌如何计数？ 真菌培养基上生长的细菌如何计数？,总好氧微生物数（TAMC）：,定义：在TSA（大豆酪蛋白琼脂）培养基上 生长的包括真菌的菌落形成单位总的 数量。 培养温度/时间： 1、细菌： 3035 5天。 2、细菌： 3035 2天； 霉菌或酵母菌： 2025 3天。,酵母菌和霉菌总数（TYMC）：,定
9、义：在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上 生长的包括细菌的菌落形成单位总的 数量。 培养温度/时间： 2025 5天。,计数原则：,1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被 作为TAMC计数的一部分。 2、TYMC时，如果细菌被发现生长，应该被 作为TYMC计数的一部分。 3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受 标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。,培养条件：,CHP2010,中国药典2010年版 二部 附录XIX Q “药品微生物实验室规范指导原则” 用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的
10、污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。,微生物良好实验室规范,假阳性（False positive）,测试结果实际应该没有微生物生长，但被 判为发现生长或阳性。 产生原因： 1、非无菌培养基平板引人污染； 2、非无菌操作带来污染。,假阴性（False negative）,测试结果实际应该有微生物生长，但被判 为未见生长或阴性。 产生原因： 1、培养基选择不正确； 2、培养基促生长试验失败； 3、培养条件不正确。,GB/T 16293-2010 / GB/T 16293-2010,附录B: B.3 培养基平皿培养及保存 制备好的培养基平皿宜在28保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用
11、适宜的方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期剂量的标记。,环境测试培养基：,1、TSA（大豆酪蛋白琼脂） 用于细菌取样。 培养温度/时间：3035 不少于2天。 2、 SDA（大豆酪蛋白琼脂） 用于霉菌和酵母菌取样。 培养温度/时间：2025 不少于5天。,环境测试培养基：,3、用户认可并验证了的培养基。 以上摘自：GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010,环境监测中常忽视的两个方面：,1、忽视洁净环境中的影响因素 2、忽视培养基的选择,1、忽视洁净环境中的影响因素,（1）API 的残留 （2）消毒剂/杀孢子剂的残留,API,抗菌素 药物活性成分,消毒剂/杀孢子剂,常见的
12、化学消毒剂： 1、酚类 2、醛类 3、过氧化氢类 4、季胺盐类化合物 5、以上混合物,2、忽视培养基的选择,（1）选择性低下，营养全面 （2）含有中和剂 （3）“无菌”平板培养基,培养基的选择,营养琼脂、虎红琼脂 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）,中和剂的使用：,参见：“中国药典”2010年版 附录109页 附录XI J 表1： “常见干扰物中和剂或灭活方法”,酶（1）：青霉素酶,青霉素酶（ -内酰胺酶） 可以有效的水解-内酰胺类抗生素。 包括： - 青霉素G - 氨基青霉素类，如氨苄西林、阿莫西林、匹氨西等 - 羧基青霉素类，如羧苄西林、替卡西林等 - 脲基青霉素类，如呋苄西林、美洛西林等 - 头
13、孢、,酶（2）：头孢菌素酶,头孢菌素酶 可以可有效水解头孢类抗生素及以上的头孢类 抗生素。 包括：头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢呋辛、 头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松等。,抵抗消毒剂的中和剂：,1、吐温-80 能够消除六氯酚和含汞类消毒剂的影响。 2、卵磷脂 能够消除洗必泰类消毒剂的影响。 3、卵磷脂、吐温-80 能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎 氯铵等）消毒剂的影响。,理想的环境测试培养基：,无菌平板培养基 （预灌装无菌培养基）,无菌平板培养基优点：,1、A级、B级、C级洁净区直接使用 2、室温储存 3、有效期长 4、无菌包装、包装完整 5、特制平板 6、培养基灌装量大,5
14、5mm接触平板（Rodac Plate）,Replicate Organism Detection and Counting GMP2010 和 EU GMP: - 平板尺寸：15 X 55 mm - 取样单位面积：25cm2,USP1116 洁净室和其它控制环境的微生物评估,接触板得取样面积： 2430cm2,ISO 14698 洁净室及其相关控制环境,取样面积：不小于20cm2 。 取样方法： 采样时培养基表面应与采样点接触不少于10s，向整个接触表面施加恒定均匀的压力（如施加的质量约为25g/cm2），不得有环形或线性运动，装置有接触并拿开后，要加盖并尽快用适当的培养条件培养。,2010 GMP实施指南,采样和检测的方法都要经过验证。,洁净环境微生物检测：方法确认,目前各类官方的指导原则中，很少有对洁净环境微生物监测测试方法提出要求的。 目前各类官方的指导原则中，各种微生物只有生长在如下两种固体表面上的测试方法：琼脂培养基和滤膜，才能够得到确认。,谢 谢！,
