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1、,糖化血红蛋白的基础知识培训,HbA1c定义,HbA1c: 葡萄糖与血红蛋白链氨基酸末端的6个氨基酸结合产生的一种特定的糖化血红蛋白 血红蛋白被糖化后，氨基酸末端所带负电荷会增加 HbA0：没有结合葡萄糖的血红蛋白链氨基酸末端的6个氨基酸 HbA1c以百分比表示，即以和葡萄糖结合的血红蛋白占全部血红蛋白的比例 正常参考范围：4%-6%（NGSP/DCCT标化的方法）,糖化血红蛋白-血红蛋白的糖基化产物,葡萄糖进入红细胞，在内部与血红蛋白发生反应,血红蛋白,葡萄糖,红细胞,糖化血红蛋白的生物合成过程（两步）,血红蛋白,葡萄糖,中间产物-LA1c Schiff碱,HbA1c,第一部：快速反应，生成
2、不稳定A1c（LA1c） 第二步：缓慢反应，生成稳定的A1c（HbA1c）,糖化和非糖化的血红蛋白,成人血红蛋白分三种 HbA为主要成人Hb,非糖化Hb,糖化Hb,血红蛋白,HbA1c是如何计算的？ A1c%=A1c/A0+HbA1,离子交换色谱所分离的组分解释 （非糖尿病样本）,胎儿血红蛋白在胎儿及出生6个月以内的新生儿体内为高浓度，6个月后基本降为成人水平 妇产科 HbA1c主要用于糖尿病妊娠的筛查,色谱图举例,HbA1a & HbA1b HbA的次要组分,LA1c (希夫碱) 和氨甲基乙酰化的 Hb,HbA1c,A0,总面积为 100万-500万,A1c 结果,小结,什么是HbA1c和H
3、bA0？ A1c被糖化后什么电荷增加了？为什么糖化血红蛋白在A0峰之前被洗脱下来？ 测量糖化血红蛋白为什么要先对样本溶血？ HbA1c是如何计算的？ 成人血红蛋白包括哪几种？ HbF是什么？浓度高时是否会对A1c造成干扰？为什么？ 伯乐的糖化试剂能报告HbF吗？为什么？ 糖化的血红蛋白包括哪几种？,HbA1c实验室检测方法,常见的HbA1c检测方法,主要有三种检测方法: 1.离子交换高压液相色谱（HPLC） 直接分离HbA1c 2.硼酸亲和高压液相色谱 检测产物为总糖化血红蛋白 3. 免疫法 检测产物为HbA1c,各检测方法的精密度,方法 精密度 电泳 + 免疫法 + 低压液相色谱（LPLC）
4、 + 高压液相色谱（HPLC） +,各检测方法的分析物,离子交换HPLC,检测糖化血红蛋白HbA1c的金标准方法 DCCT研究中唯一所采用的HbA1c检测方法 NGSP标准化的参考方法 检测原理： 基于HbA1c 与其它血红蛋白组分所带电荷不同，在一定的缓冲液离子强度下可与分析柱树脂表面偶联的离子基团有不同程度的结合，从而将HbA1c与其它组分(HbA1b, HbA1a,HbF,HbA0) 区分开而得到分离。,离子交换HPLC检测原理,色谱图的横坐标是时间，纵坐标是信号强度，反映Hb各分析峰浓度的高低,被校准的峰被阴影化,离子交换HPLC的特点,采用离子交换原理基于HPLC的平台 HPLC方法
5、的试剂组成包括：分析柱、缓冲液、校准品 采用分析柱内填充的离子交换树脂作为固定相，树脂上面偶联了带电荷基团 以可形成不同离子强度洗脱梯度的缓冲试剂作为流动相。 溯源性由试剂盒配套的校准品保证 分离效果的影响因素 分析柱内的填充物（颗粒越小，分离效果越好，速度越慢） 分析柱柱长（越长，分离效果越好，速度越慢）,离子交换HPLC的优缺点,优点： 1.全自动 2.结果准确，可靠 分析物为HbA1c。 高分辨率方法可同时区分常见血红蛋白变异体，给临床医生已额外的医疗提示 3. 精密度好 CV3% 缺点： 需要单独的检测设备 试剂成本较高 （操作人员对异常色谱图的辨别有一定的要求）,硼酸亲和色谱法,血红
6、蛋白被糖化后，会产生一个特殊的顺式二糖醇基团，该基团可与分析柱上的硼酸基团之间特异和可逆的结合； 而非糖化血红蛋白（A0）不与分析柱结合，最先被洗脱出来 从而实现糖化成分与非糖化成分分离，检测物为总糖化血红蛋白 HbA1c的结果是计算出来的,硼酸亲和HPLC的优缺点,优点： 仅区分糖化和非糖化，不受变异体的检测干扰 缺点： 非直接检测HbA1c，HbA1c存在计算错误的可能 胎儿血红蛋白高的病人结果偏低 血红蛋白变异体纯合子（如HbSS）的病人仍然报告HbA1c 不能区分血红蛋白变异体，无法给临床以额外的信息,抗原抗体反应 试剂有一种特有的凝集物导致抗体-乳胶的凝集，浊度增加 HbA1c与抗体
7、-乳胶的结合对凝集物的凝集有抑制作用，浊度降低,免疫分析法,免疫分析法的特点,基于生化分析仪的平台（需要手工预处理样品） 精密度一般较差（CV%5%） 只报HbA1c一个数值，不能检测血红蛋白变异体 高血红蛋白F样本的HbA1c检测结果偏低 严重的黄疸和高脂血影响比色结果 国产糖化试剂的非标准化问题,小结,糖化血红蛋白的主要检测方法有什么？检测产物分别是什么？ HPLC的中文全称是什么？ HbA1c检测的金标准方法是？为什么？ 离子交换HPLC的检测原理是基于什么的不同？检测试剂应该包括哪些主要的组分？ 分析柱中填充的是什么？上面偶联了什么？不同缓冲液的区别是什么？ 不同离子交换HPLC方法的
8、分辨率一样吗？分辨率的关键影响因素是什么？ 糖化血红蛋白检测结果的溯源性由哪种试剂保证？ 伯乐糖化产品的色谱图横坐标是什么？纵坐标是什么？ 硼酸亲和色谱法的检测原理是基于什么？色谱图有几个峰？分别是什么？ 硼酸亲和色谱法是怎么检测HbA1c的？ 免疫法检测糖化血红蛋白的原理是基于什么反应？ 国产免疫法试剂的缺点有哪些？,HbA1c实验室检测干扰因素,常见检测干扰因素,非方法学特异的干扰因素 改变红细胞寿命的生理条件可影响 HbA1c结果 导致检测结果假性偏低 镰刀细胞性贫血和溶血性贫血 维他命 C和 E （抑制糖化作用） 导致检测结果假性偏高 铁缺乏性贫血，脾切除术后 真性红细胞增多症（高原地
9、区） 妊娠期 Hb浓度偏低，HbA1c比正常人偏低,方法学特异的干扰因素 血红蛋白变异体 (如.HbS, HbC， HbD, HbE) 血红蛋白衍生物 (乙酰化、甲酰化衍生物等) 长期服用阿斯匹林的病人，体内乙酰化Hb高，结果偏高 肾衰病人的氨甲酰基化，导致结果偏高 Schiff碱（A1c中间产物） 某些血糖浓度急剧变化的1型糖尿病人，Schiff碱升高， 胎儿血红蛋白HbF 严重的黄疸、高血脂,血红蛋白变异体的发生率,全世界已经发现了超过一千种血红蛋白变异体 全球的血红蛋白变异体发生率的最新数据是7%* 非洲裔美国人：HbS 7.8%；HbC 2.3% 1988年,2.5 ,河南* 2001
10、年,3.2 ,丝绸之路* 云南：4% 云南省的阿昌族HbE的发病率为41.2%,*Kohne E. Hemoglobinopathies: clinical manifestations, diagnosis, and treatment. 1. Dtsch Arztebl Int. 2011;108(31-32):532-540. *河南省异常血红蛋白的调查与化学结构的分析研究,新乡医学院学报, 1988, (02) 9-12 *中国丝绸之路地区血红蛋白病的遗传流行病学的特点，人类学学报，2001，V20,变异体对HbA1c准确性的影响,Ross J.Molinaro,Targeting H
11、bA1c:standardization and clinical laboratory measurement. MLO Jan,2008,血红蛋白变异体对HbA1c结果准确性的影响,对部分方法的检测结果准确性有影响 例： A0后有变异体的糖尿病人样本， HbF正常 G8标准模式试剂的检测结果偏低1%,G8 Variant 模式试剂（1.6分钟/test）,G8 标准模式试剂 （1.0分钟/test）,血红蛋白变异体与血糖监控,血红蛋白变异体会影响红细胞的寿命，红细胞的寿命会影响糖化血红蛋白的生成 这些病人或许应该有不同的糖化血红蛋白的监控时间或者改用其他指标来评估血糖,小结,影响HbA1c
12、检测结果的非方法学特异的干扰因素 影响HbA1c检测的方法学特异的干扰因素有哪些？ 变异体与A0没有分离开的情况下会导致检测结果偏高还是偏低？为什么？ 变异体与A1c没有分离开的情况下会导致检测结果偏高还是偏低？为什么？ 血红蛋白变异体会通过两个方面影响糖化血红蛋白，请详述。 临床上对于有血红蛋白变异体的病人有什么建议？实验室应该怎么满足临床的这一需求？,糖化血红蛋白实验室检测指南的要求,2013年中国糖尿病杂志8月刊,分析系统的要求,测定方法要求溯源到IFCC参考方法，如NGSP认证方法 （NGSP认证的有效期是1年） 2. 实验室要知晓所选分析系统可能存在的干扰因素 3. POCT方法的精
13、确性不能满足临床要求，目前不能用于糖尿病的诊断,中国三级医院的实验室检测情况,数据统计于NCCL历年室间质评数据,采用NGSP标准化方法的实验室占比81%,HbA1c,Total GHB,HbA1,在DCCT和UKPD结果发表之前，美国有800个试验室在做A1c检测，CAP实验调查显示在不同的实验室，用不同的检测方法得出的A1c结果存有巨大的差异。,HbA1c检测的标准化,美国从1996年起开展国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP），在HbA1c的检测值一致性方面取得了巨大成功 在NGSP的中心实验室所采用的参考方法是 离子交换HPLC NGSP 由指导委员会和实验室网络组成。实验室网络包括一
14、级中心参考实验室（CPRL）、一级参考实验室（PRL）和二级参考实验室（SRL）,目的: 1. 糖化血红蛋白检测项目实现标准化 2. 以使各临床试验室的检测结果与DCCT的报告结果具有可比性 ( 该DCCT试验建立了平均血糖与糖尿病并发症的发病风险之间的关系),www.ngsp.org,NGSP 程序,NGSP标准化对A1c检测的贡献 从无序到有序,2008年调查显示2000多家CAP实验室间使用不同的检测方法的CVs在1.3-7.1%之间，基于A1c检测结果已经能够有效的标准化,IFCC标准化,2002年IFCC发表文件， 正式推荐 HbA1c检测的参考方法为HPLC-MS(质谱)或HPLC
15、-CE(毛细管电泳) 校准品为纯化的 HbAo 和 HbA1c 混合物，共 6 个浓度 室内CV0.472.07%；室间CV1.352.27%,但是，NGSP和IFCC方法检测HbA1c值存在1%-2%的差异,非糖尿病范围,控制目标,需采取治疗措施,各个标准与IFCC之间的转换,JDS/JSCC% = 0.927*IFCC% + 1.73,NGSP% = 0.915 * IFCC% + 2.15,Sweden% = 0.989 * IFCC% + 0.88,HbA1c的检测必须在世界范围内标准化，包括参考系统和数值报告 IFCC的参考系统是唯一的标准化参考系统 HbA1c以IFCC单位(mmo
16、l/mol)以及转换的NGSP units (%)报告，使用IFCC-NGSP换算公式 需要确保基层糖尿病容易获得IFCC和NGSP转换公式 杂志编辑和出版物建议采用SI (IFCC) 和NGSP双重单位报告HbA1c 糖化血红蛋白的标准化称谓为HbA1c，在指南或教育材料中也可以简写为A1C,2010年HbA1c标准化第二次全球共识 (ADA、EASD、IDF、IFCC和ISPAD),2010 in Annals of Clinical Biochemistry, Clinical Chemistry, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Diabetes Care, Diabetes Research and Clinical Practice, Diabetologi
