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1、（一）高效液相基础知识 高志国 （2017.03.29）,2017年样品检测组操作技能培训,色谱法原理与分类 HPLC的组成 HPLC的应用 HPLC色谱图名词术语 HPLC定量分析原理,高效液相色谱基础知识,什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类,色谱法原理及分类,色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代,什么是色谱法,100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,
2、再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的 Chromatography(色谱法),色谱法(Chromatography)溯源,一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中 随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带 分离出不同的化合物 Chromato - 颜色 Graphy - 图象,Tswett（茨维特)的实验,是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互
3、分离 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase) 有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂,色谱法原理,相(Phase): 物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成 分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相 之间有明显可分的界面,色谱分离原理,按流动相的物态分: 气相色谱 (Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱 (Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂),色谱法的分类,按固定相的形态分: 平面色谱 o 纸色谱 o 薄层色谱 柱色谱,色
4、谱法的分类,色谱法的分类示意图,高效液相色谱法 HPLC(High Performance Liquid Chromatography ) 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段: o High 高 o Performance 性能 o Liquid 液体的 o Performance 色谱,什么是HPLC？,特点：高压、高效、高速、高灵敏度 1. 高效分离 ： n =105 /米 2. 高速 ：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟 3. 高灵敏度 ：检测下限：10-9-10-13g（最小检测量） 4. 自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站 5. 应用范围广 ：可测有机
5、物75%-80% 适用：高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离,HPLC特点,按流动相和固定相的相对极性分: 正相色谱(Normal Phase Chromatography) o 固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reversed Phase Chromatography) o 固定相的极性小于流动相 有机化合物的极性 分子间作用力(静电引力,偶分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种表述,液相色谱法的分类,有机化合物极性示例,按分离过程的机理分: 1 吸附色谱(Absorption Chromatography) 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分
6、离 2 分配色谱(Partition Chromatography) 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 3 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography) 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) 4 体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel Permeation Chromatography) 固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液,液相色谱法的分类,由五大部分组成： 溶剂
7、输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测系统（检测器等） 记录及数据处理系统,HPLC的组成,1. 高压输液泵 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,高压输液泵： 恒压泵（流量随阻力变化重现性差） 恒流泵（多用）：往复式 注射式,作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。 性能：有足够的压力 输出流量恒定，可调 输出压力平稳 泵室体积小 泵体抗腐蚀、耐酸,梯度洗脱装置 作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续改变
8、配比，以改变流动相极性、离子强度、 PH值、提高分离效率。 低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，1个泵。） 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）,安捷伦泵：小视频,色谱学堂：泵,高效液相色谱仪流动相脱气的目的 1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。 2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。 3、防止气泡引起尖峰。 4、使基线稳定，提高信噪比。 5、降低溶剂的紫外吸收本底。 6、减少死体积。 7、防止填料氧化。 视频 ：脱气目的 在线脱气机,在线脱气机,2. 进样装置,进样视频：安捷伦,进样视频：岛津,3. 分离系统 包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径
9、为2 6mm，柱长为10 50cm，柱形多为直形，内部充满310 mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温 匀浆法填充柱： 将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱 液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米,4. 检测器 要求: 灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快, 对温度和流速的变化不敏感 检测器类型 1.紫外可见吸收检测器(UVD) 2.荧光检测器(FD) 3.蒸发光检测器（ELSD） 3.示差折光检测器(RID) 4.电化学检测器(ED) 5.化学发光检测器(CD),1. 紫外可见光度检测器： 固定波长：254nm ， 低压汞灯。 可调波长：190800mm， 钨灯，氘灯。 光电二
10、极管矩阵检测器： 190700nm。,光电二极管矩阵检测器特点： 灵敏度高、分辨率好、方便、快速、准确，可扫描得三维流出曲线 紫外检测器的应用： 对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。 紫外检测器的特点： 灵敏度高 最小检测浓度10-9g/ml 线性范围宽 对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱 应用范围广,折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）,因 nf（T），故需精密恒温（0.001） 灵敏度低于UV检测器，且不适合于梯度洗脱 用于无紫外吸收的化合物，如糖类,2. 荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片） 荧光分光检测器（光栅分光） 氘灯作激发光源，波长范围250600nm 应用：组分吸收
11、一定波长紫外光后发射荧光的物质，且荧光强度与浓度成正比。 特点：灵敏度更高 检测限10-1210-13g/ml（灵敏度比UV检测器高23个数量级） 选择性好 对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱 所需试样量少，适于痕量分析 应用范围广 3、电化学检测器 电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。,伏安计、安培计、库仑计和电导计等, 首选安培计 可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质 电极表面易中毒,温 度：1030； 相对湿度：80； 最好是恒温、恒湿 远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施,HPLC的日常维护与保养,HPLC的日常操作条件：,1 Alliance液相色谱系统日常维护
12、：开机程序 2 Alliance液相色谱系统日常维护：开机程序,HPLC的日常操作,选择流动相时应注意的几个问题：,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,手柄位在Load位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中(定量环充满后，多余样品从放空孔排出) 手柄转动至Inject位置时，阀与液相
13、流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析,工作原理：,1. 六通阀进样器的使用及保养,手柄转动要快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留,部分装液法：进样量最多为定量环体积的75 要求每次进样体积准确、相同 完全装液法：进样量最少为定量环体积的3至5倍 将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精密度及重现性,两种装液方法:,样品必须过滤：用0.45(0.22)m的滤膜过滤 防止微粒阻塞进样阀 减少对进样阀的磨损 进样结束冲洗进样器： 用不含盐的稀释剂、水或
14、不含盐的流动相冲洗， 在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗 再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧,使用流动相尽量要清洁 进液处的砂芯过滤头要经常清洗 流动相交换时要防止沉淀 避免泵内堵塞或有气泡 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染,2. 泵的保养,在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱 当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯；严格控制进样量,2. 色谱柱的保养,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存
15、并封闭,在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器； 在分析完成后马上关闭检测器,3. 紫外灯的保养,“分析型液相色谱” 目的:得到数据-定性及定量分析 灵敏度的要求 样品的复杂性 样品量的要求 精度及准确度的要求 容易使用,HPLC的应用,“制备型液相色谱” 目的:得到纯品-分离及纯化 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性,色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间,HPLC色谱图名词术语,色谱峰(Peak):):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号 峰底
16、(Peak Base):):峰的起点与终点之间连接的直线 峰高(Peak Height):):峰最大值到峰底的距离 峰面积(Peak Area):):峰与峰底之间的面积,又称响应值,色谱图名词术语:,基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声(N)N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力 等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,色谱图名词术语:,保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留的组分,从进 样到出现峰最大值所需的时间 保留体积(VR)(Retention volume):组分从进样到出现峰最大值所需的流动相
