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1、oct4、sox2、klf4和nanog基因简介1、Oct4基因就是其中一个关键基因，也被称为Oct3、POU5F1、Oct3或Oct4，是POU转录因子家族中的一员。人的Oct4基因位于6号染色体上(6p21.31)，长度为16.40kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mRNA亚型(Isoform)，从而翻译成多种蛋白质。Oct4 Isoform 1是转录的主要亚型之一，具有5个外显子，4个内含子，翻译的蛋白质含有一个保守的DNA结合结构域POU结合域，它能与含八聚体基序(octamer motif)的DNA结合从而调控下游靶基因的转录。目前关于Oct4基因的研究主要针对Isoform 1
2、，在鼠和人体内，它主要表达于胚胎干细胞及生殖干细胞中，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。Oct4基因的调节通路BOYER等鉴定出人类胚胎干细胞中有623个(3)蛋白质编码基因和5个(3)miRNA编码基因的启动子与Oct4关联。这些基因包括许多以往在小鼠胚胎干细胞研究工作中所确定或假定的Oct4靶基因，如S0x2、Nanog、LEFTY2EBAF、CDX2、HANDl、DPPA4、GJAlCONNEXIN43、FOX01A、CRIPTOT1)GFl和ZIC3等。这些基因大约一半是Oct4、Sox2和Nanog共同的靶基因，包括参与维持胚胎细胞多潜能性和自我更新的重要调节
3、通路Tgf-1(如TDGFl、LEFTY2EBAF)和Wnt(如DKKl、FRA=r2)的基因。多项研究也表明了Oct4基因对形成和维持胚胎干细胞的多能性和自我更新是和sox2和Nanog共同完成的。在人胚胎干细胞中，Oct4、Sox2和Nanog也可能通过调节STAT 3的表达来调控JAK-STAT 3信号转导通路，从而对细胞的增殖分化产生作用。RODDA等研究认为Sox2-Oct4属于多能性基因调节的顶级层次，它们联合控制Nanog并通过下游基因Esrrb、Rifl等调节细胞的多能性。TAKAHASHI和YAMANAKA28研究发现，多潜能性干细胞可以通过加入4种因子Oct34、Sox2，
4、c-Myc和KIf4从鼠成纤维细胞中得到，而Nanog并不是必要的。Oct4缺失的胚胎于细胞即使有Nanog表达，也不能起到维持胚胎干细胞不分化的作用29|。MASUI等30研究认为Sox2通过直接或者间接方式调节Oct4的表达，进而影响胚胎干细胞的多潜能性，Sox2敲除的鼠胚胎干细胞只要维持Oct4的表达就可以阻止其分化。因此，Oct4在维持胚胎干细胞方面可能更据主导地位，这与诱导多潜能性干细胞的实验结论一致。Oct4基因与肿瘤作为胚胎干细胞的特异性基因，Oct4主要表达于胚胎和生殖细胞肿瘤中，如睾丸生殖细胞瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌和胚胎癌细胞系中。非生殖系统肿瘤细胞中表达Oct4的现象可以
5、解释为细胞癌变过程中胚胎基因的激活，或者说是干细胞致癌的一种证据。然而，LEENDERT等利用100多种肿瘤组织芯片的3 439个标本进行Oct4基因表达情况筛查时却发现该基因在非生殖细胞肿瘤中几乎不表达，偶见于肺鳞癌和大细胞癌以及肾透明细胞癌中。这就出现了Oct4基因在肿瘤细胞系中的大量表达现象和目前研究结果在组织水平上(除膀胱癌外)基本不表达的结论之间的矛盾。有趣的是对于这种现象的解释，研究者很自然地倾向于肿瘤于细胞，因为肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例极少。Oct4基因与肿瘤作为胚胎干细胞的特异性基因，Oct4主要表达于胚胎和生殖细胞肿瘤中，如睾丸生殖细胞瘤、精原细胞瘤、胚胎性癌和胚胎癌细
6、胞系中。部分研究者开始质疑Oct4蛋白在非胚胎性肿瘤细胞系和组织中的表达可能是假基因和亚型的影响，甚至是实验过程中对照设置的不合理而过度曝光造成的。参见“Oct4基因的研究进展2010”。2、晡乳动物性别决定基因sry决定着正常雄性睾丸的发育，其缺失或突变与性逆转密切相关。sry基因的突变，可产生XY个体的性逆转，使个体发育为雌性。1990年首先克隆了人的sry基因。在人和鼠中，sry基因位于Y染色体上，其编码的蛋白SRY包括一个79个氨基酸的DNA结合区域，此区域和细胞核内非组蛋白染色体蛋白HMG1和HMG2同源，称为HMG box(high-mobilitygroup box)。HMG b
7、ox在许多蛋白中厂泛存在，从而构成了HMG box超家族。正是由于sry基因的发现才导致了一个新的基因家族- sox(sry-related HMG box-containing)基因家族的发珊”。sox基因家族编码一组进化上高度保守、结构上与SRY相关的转录因子，其包含的HMG-box与SRYlsry的HMG-box具有高度(50%)的氨基酸序列相似性。1995年，Yuan等们首先从胚胎癌细胞的cDNA文库中克隆了小鼠sox2的全长cDNA。1996年，Collignon等又用人的sry基因作探针筛选8.5日的老鼠胚胎cDNA文库，分离出sox2的全长cDNA。小鼠的sox2基因定位于第3号
8、染色体上。研究表明，sox2 与大多数sox基因一样为单外显子结构，并随机分散存在于整个基因组，不形成基因簇。HMG-box中可能曾经包含一个内含子，此内含子仍在tcf基因及一些sox基因中出现，但在sox2等大多数基因中早已丢失。推测缺乏内含子的基因由逆转录及倒位产生。参加“转录因子Sox2的研究进展2004姚鑫院士”。3、2006 年，Kazutoshi 等1首次证实，Klf4、Sox2、Oct4 和 c-Myc 转录因子能够将小鼠成纤维细胞诱导成 iPS 细胞，因此，这 4 种转录因子在体细胞重编程中的作用机制和功能研究已成为相关领域的热点。人的 Klf4 基因定位于染色体 9q31 ，
9、 覆盖 6.3kb的基因段，有 5 个外显子。其 cDNA 编码区长度为1 413bp ，编码一个由 470 个氨基酸残基组成的多肽; 而小鼠的klf4 定位于染色体4B3 ， 小鼠Klf4蛋白全长包含 483 个氨基酸残基， 与人 Klf4 蛋白氨基酸序列的同源性为 91%，在羧基端有 103 个氨基酸残基完全一致2。通过 RNA 转移吸印技术分析显示，人和鼠的 Klf4 转录物长度均为 3.5kb ，相对分子质量为 53k ，但在小鼠组织中表达水平更高3。猪的 Klf4 基因位于染色体 1q28 29 处，编码序列全长为 1 533bp。Klf4曾被命名为胃肠富集Kruppel 样因子5或
10、表皮锌指因子2，主要在消化道和上皮细胞中表达，在口腔、食管上皮、皮肤表皮、胸腺上皮及血管内皮等处也有广泛表达6。Klf4 是一种具有结合位点特异性真核生物锌指蛋白转录因子，属于 Klf 蛋白家族一员，具备 Klf 蛋白家族的结构特性。Klf4主要特征是包含 3 个结构域：DNA 结合结构域、转录调节结构域和核定位序列。高度保守的 DNA 结合结构域位于羧基端，一般用来调节 DNA 结合的特异性；而高变性的转录调节结构域位于氨基端，主要发挥转录激活和抑制作用。目前推测Klf4在iPS 细胞中参与维持细胞多潜能性的机制有以下几方面：首先，Klf4 能和 c-Myc 一起改变染色质的结构， 从而使决
11、定细胞多潜能性的 Oct4和Sox2 两种基因能结合到它们的靶部位， 以便提高细胞诱导的效率39; 其次，是 Klf4 在细胞生长、增殖、分化及胚胎发育中都发挥着重要作用，Klf4 既可作为原癌基因又可作为肿瘤抑制蛋白，过量表达抑制 ES 细胞分化，但能促进自我更新41; 再次，Klf4在诱导多能性干细胞过程中可以与p300 组蛋白乙酰转移酶相互作用调节基因转录18。 研究发现在稳定传代的 iPS 细胞中出现转基因沉默，由此推测外源性 Klf4、Sox2、Oct4、c-Myc 仅参与启动体细胞重编程过程，而并非维持细胞多能性，细胞多能性的维持主要是由外源Klf4 激活的内源Klf4 参与调节4
12、2。 至于 Klf4 在诱导 iPS 细胞中发挥的其他功能及具体的作用机制还有待进一步研究。在这四种转录因子中， Klf4的表达模式与Oct4相近， 当 Klf4 过表达时能维持 Oct4的表达1。 Klf4通过直接抑制 p53 的表达来抑制 c-Myc 诱导编程性细胞死亡，同样 c-Myc 也反过来抑制 Klf4 的抗增殖能力43。Klf4 与 c-Myc 这种动态平衡在诱导 iPS 细胞的过程中发挥着重要作用，但 Klf4 和 c-Myc 这两个基因既是多潜能相关的转录因子，也是潜在的致癌基因，这使人们担心 iPS 细胞的应用可能会诱导癌症的发生。在临床应用中为了寻找一种更简单、更安全，并
13、能减少所需转基因数量和避免对原癌基因 c-Myc 需要的程序，Kim 等44报道仅需 Oct4与 Klf4 或 c-Myc 两种转录因子中的一种组合就能从成年小鼠神经干细胞中获得 iPS 细胞，因为内源性Sox2和 c-Myc在神经细胞中的表达水平远高于 ES 细胞。另有研究者试图使用小分子化合物来替代潜在致癌转录因子进行 iPS 细胞的诱导，或通过替换病毒载体来诱导 iPS 细胞。Shi 等45用 BIX-01294 和BayK8644 两种小分子混合物处理转染Oct4/Klf4的小鼠胎儿成纤维细胞， 也成功产生iPS 细胞。 Okita等46使用两个质粒取代病毒载体，一个质粒运载 c-My
14、c基因，另一个质粒运载 Oct4、Klf4 和 Sox2 基因；然后把两个质粒同时导入小鼠胎儿成纤维细胞，成功培育出 iPS 细胞。这些研究成果为我们提供了一种获得 iPS 细胞更简便，相对较安全的新思路。参见“Klf4 的功能研究进展2009安徽农大动科学院刘亚”。4、2003年，Mitsui和Chambers等几乎同对报道，并且正式命名了Nanog基因，这是一种在内细胞团、原始生殖细胞以及ESCs表达的新转录因子。Nanog基因属于ANTP类，NK家族基因，在人定位于12号染色体12p13 31。其cDNA由2184个核苷酸组成，包含一个开放阅读框，编码305个氨基酸。Nanog基因在ES
15、Cs的作用机制与调控特点无论小鼠还是人的ESCs转录调控，都以Oct4、Sox2和Nanog这3个转录因子为核心。这3个调控因子，缺少任何一个，ESCs都会发生分化，它们都是维持ESCs特性所必需的。其中，Sox2属于高泳动类非组蛋白盒结构域蛋白，Nanog和Oct4属于同源盒结构域蛋白。Sox2是通过保持Oct4的适当表达水平稳定ESCs的多能性，而Nanog和Oct4主要通过阻断ESCs的分化维持多能性。FoxD3是Winged helix/forkhead辕录因子家族中的一员，主要在ESCs等多能细胞中表达。有学者认为，Oct4、Nanog、FoxD3之间形成了一个负反馈调节环路来控制E
16、SCs亚全能性与白我增殖，即Oct4直接作用于Nanog，使Nanog维持在一个亚稳定状态的浓度（而不会达到或超过稳定状态的水平）；然而FoxD3可以抑制Oct4对Nanog的这种效应；同时FoxD3和Nanog可以促进Oct4的表达，而Oct4的过表达又会受到白身反馈抑制，这样，这三者之间就形成了一个相互依赖的调节网络以维持ESCs的自我更新能力。也有研究表明，FoxD3作为一个调控分子，能直接与Nanog启动子区结合，从而对Nanog发挥正调控作用。p53是Nanog的一个负调控子。转录因子3为Nanog的另一个负调控子，能结合到Nanog启动子区，并限制Nanog的表达，最新研究显示，Wnt途径中转录因子3通过调控ESCs的Nanog和Oct4等核心因子，使ESCs在维持多能性与分化之间保持
