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1、基因工程 第一节： DNA重组技术的基本工具 浚县一中 刘秀荣,据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人 中国卫生部通报：2004年月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100% .,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因植物,基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人类需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术。,概念分析：,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可
2、培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花 抗虫棉,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,重组DNA,导入,形成,基因工程培育抗虫棉的简要过程,基因工程培育抗虫棉的关键步骤,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,1.1 DNA重组技术的基本工具,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,“分子手
3、术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,主要来源：,2.种类与命名：,3.作用：,4.作用结果：,主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。,约4000种,识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。,形成粘性末端或平末端,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物
4、中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,go back,现在已经从约300种微生物中分离出约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens）,大肠杆菌 （Escherichia coli R）,练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,限制酶的识别序列：,能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列： 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。,限制性核酸内切酶作用的是DN
5、A分子中的什么键？,磷酸二酯键 即脱氧核糖、磷酸之间的连接,A,G,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端 平末端,限制酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.（双链）,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,目的基因所在DNA片段,载体DNA片段,EcoR,EcoR,DNA连接酶,1.作用:,把切下来的DNA片段拼接
6、成新的DNA.,2.作用原理：,催化磷酸二酯键形成,3.种类：, Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶,“分子缝合针” DNA连接酶,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶 或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,双链,单链,在两DNA片段之间形 成磷酸二酯键,将单个核苷酸加 到已存在的核酸 片段的3末端的 羟基上，形成磷 酸二酯键,都能形成磷酸二酯键 二者都是蛋白质类化合物,尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端,C
7、TTCATGAATTCCCTAA,GAAGTACTTAAGGGATT,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,1.作用：,2.条件：,3.种类：质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒等。,将外源基因送入受体细胞。,有1多个限制酶切点 对受体细胞无害 使导入基因能在受体细胞中复制、表达 有某些标记基因，便于筛选,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,作为载体的必要条件:,Go back,质粒的特点：,是一种裸露的、结构简
8、单、独立于细菌拟核DNA分子外并能自我复制的小型双链环状DNA分子。,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,基因工程 的工具,限制酶,主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键,DNA连 接酶,连接磷酸二酯键,种类,E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶,载体,具备的 条件,质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒,种类,能自我复制 有一个或多个酶切割位点 有标记基因 对受体细胞无害,思考与探究 P7,2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具
9、备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供
10、目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所
11、发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,1)不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,2）有关基因工程的叙述中，正确的是（ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的 核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有 多个限制酶 切点，以便与目的基因连接 D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间 形成氢键,C,练习,3）同一种限制酶切割成的黏性末端是,A. B. C. D. ,A,（10江苏卷）4.下
12、表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：,（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。 （2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越 。,（1）0、2 （2）高,（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma 切割，原因是 。 （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。,（3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 （4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。 （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。,（5）DNA连接 （6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞,
