dna的重组与转座培训教材.ppt

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1、第 6 章 DNA的重组与转座 Chapter 6 DNA Recombinant and Transposition,2013.10.29,1、通常DNA自发变化都是通过 作用很快 被校正，但在极少情况下，DNA将变化的部分保 留下来导致永久的序列变化，称为： 。 2、DNA复制过程中发生的DNA变化称为 。 损伤的修复方式有 ; ; ; ; , 其中以 为主。,填 空,DNA修复,突变,损伤,错配修复,直接修复,切除修复,重组修复,SOS系统,切除修复,1、紫外线照射对DNA分子的损伤主要是: ( ) A.碱基替换； B.磷酸酯键断裂； C.碱基丢失； D.形成共价连接的嘧啶二聚体。,选

2、择,D,2、比较真核生物与原核生物的DNA复制,二 者的相同之处是： ( ) A.引物长度较短； B.合成方向是53； C.冈崎片段长度短； D.有多个复制起始点； E.DNA复制的速度较慢 (50dNTP/s).,B,3、着色性干皮病是人类的一种遗传性皮肤病,患 者皮肤经阳光照射后易发展为皮肤癌,该病的分子机理是：( ) A. 细胞膜通透性缺陷引起迅速失水; B. 在阳光下使温度敏感性转移酶类失活; C. 因紫外线照射诱导了有毒力的前病毒; D. 细胞不能合成类胡萝卜素型化合物; E. DNA修复系统有缺陷。,E,6,6.1 同源重组 6.1.1 同源重组的分子模型 6.1.2 异源双链与基

3、因转换 6.1.3 细菌基因转移与重组 6.1.3.1 细菌的接合作用 6.1.3.2 遗传转化 6.1.3.3 细菌的转导 6.1.3.4 细菌的细胞融合 6.2 DNA重组技术 6.3 特异位点重组 6.3.1噬菌体DNA整合与 切除 6.3.2 细菌的特异位点重组,6.4 DNA的转座 6.4.1 转座子的概念 6.4.2 转座子的分类 6.4.2.1 插入序列(IS因子) 6.4.2.2 复合转座子(Tn) 6.4.3 转座子转座的机制 6.4.4 转座子转座的特征 6.4.5 转座引起遗传学效应 6.4.6 真核生物的转座因子 6.5 逆转录转座子 6.4.1逆转座子的结构特点 6.

4、4.2逆转座子的作用机制 6.4.3逆转座子的生物学意义,第六章 DNA的重组与转座,7,重组的概念： DNA分子内或间发生遗传信息的重新组合，称遗传重组（染色体水平）或基因重排(分子水平)。重组产物称为重组DNA (recombinant DNA)。 DNA重组对生物进化起关键作用。进化以不断产生可遗传的变异为基础，首先是突变和重组，由此产生遗传变异，然后才有遗传漂变和自然选择，才有生物进化。 重组的意义： 能迅速增加群体遗传多样性，使有利与不利突变分开，通过优化组合积累有用的遗传信息。 重组参与许多重要生物学过程，为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。 某些生物的基因表达受到重组调节。,8,

5、同源重组及其分子模型 概念：由两条同源区DNA分子通过配对、链断裂和再连接，产生片段间交换的过程。 Holliday 模型（能解释同源重组现象） 四个关键步骤： 两个同源染色体DNA相互靠近并排列整齐； 在同一部位两条单链断裂，引发重组； 断裂的单链游离端彼此交换，每条链与另一对应链连接，形成Holliday中间体; 分支迁移产生异源双链。两分子间交点沿DNA移动，方向任意。,9,两个同源染色体DNA排列整齐； 两分子同一部位两个单链断裂，引发重组； 断裂后形成单链3游离端，后者侵入到双链DNA内，寻找同源区域并配对结合，产生短的链置换区； 断裂单链游离端彼此交换，每条链与另一对应链连接，形成

6、Holliday中间体,10,通过RuvA和RuvB引发分支迁移，产生异源双链DNA； 通过RuvC形成拆分口，将四链DNA复合体按不同方向拆分，形成片段重组体和拼接重组体。,12,Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNA。异构化后通过不同切割方式产生不同重组分子： 如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称拼接重组体（左），但如切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称片段重组体（右）,13,14,同源重组的过程很精确，一个核苷酸的差错都会造成基因失活。 同源重组的分子基础是DNA链间配对，通过碱基配对才能

7、找到正确的位置进行链交换。 实验表明，两个DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才能发生同源重组，小于此数值时将显著降低重组率。,15,同源重组的酶学分子基础： RecBCD途径： 起始于对重组DNA分子中的一条双链DNA进行双链切断。 RecBCD蛋白(RecB、RecC和RecD基因的产物)结合到DNA双链断裂位点，并利用RecBCD蛋白本身具有的DNA解旋酶活性，向具有5-GCTGGTGG-3序列的Chi位点进行DNA解旋。,16,(1) Chi位点和RecBCD核酸酶 原核生物有许多引发重组的方式 Chi位点能激发重组： 存在于大肠杆菌的Chi位点,含非对称8 bp序列（5-GCTG

8、GTGG-3）每510 kb出现一次. 当：1）DNA以游离单链3端形式存在时 【辐射损伤、基因组经滚环复制产生】 2）噬菌体的一些突变体， 3）单一碱基对的改变 都能产生激发重组的Chi位点。,17,Chi位点是基因rec BCD编码的RecBCD酶 作用靶位. RecBCD是多功能酶，有三种活性： 依赖ATP核酸外切酶活性； 可被ATP增强的核酸内切酶活性； ATP依赖的解螺旋酶活性。,18,当DNA分子断裂， RecBCD即结合在游离端，使双链解旋并降解; 酶移动到Chi位点3侧46个nt ，将链切开，产生3游离单链端。 3游离单链端引发异源双链形成。 RecA在3端与同源双螺旋序列反应

9、产生交联分子。,19,在E.coli基因组中平均每5000bp就有一个Chi位点。 RecBCD蛋白还具有外切双链和单链的活性，也具有单链内切核酸酶活性。 使RecBCD蛋白可产生3单链末端，该末端能被RecA蛋白和SSB包裹。RecBCD蛋白也协助RecA装载到3-DNA末端。RecA蛋白使单链末端侵入到其它双链DNA内，寻找能配对的同源区域，进而配对结合，当配对区间延伸扩展，产生链置换区-（分支迁移） 。,20,分支迁移实际上是在RuvC作用下，两条DNA分子之间交叉的同源单链互相置换的结果，迁移方向可朝向DNA分子的任意一端。 因此，在重组区段每条双链中均有一段DNA单链来自另一个双链中

10、的相对链，这一部分称为异源双链（hetero duplex）。,21,RecBCD蛋白能产生3末端并发动该末端侵入双链DNA的过程依赖于ATP和Mg2+两种物质的相对浓度。 机制如下： RecBCD蛋白首先 结合在双链DNA上 并使之解链；,22,当ATP浓度大于Mg2+浓度时，大部分Mg2+被ATP螯合。RecBCD蛋白的解旋酶活性向着Chi位点方向打开DNA双链，形成有3末端的凸形DNA结构。当RecBCD到达Chi位点，就切割Chi位点下游的核苷酸，且由RecA蛋白包裹环凸的DNA，RecBCD继续解开DNA螺旋，形成3端覆盖着RecA蛋白的单链3末端；,23,当Mg2+浓度大于ATP浓

11、度时，大量Mg2+未被螯合，RecBCD蛋白解旋酶活性同样向着Chi方向打开DNA双链，形成有3末端的凸形结构，在环后降解DNA，当RecBCD蛋白到达Chi位点时，RecA蛋白结合到环突DNA上，RecBCD停止降解3末端。开始切割5末端的链，并激活53外切核酸活性，降解5端的链，最终留下一个覆盖着RecA的单链DNA。,Chi位点 在细菌中通常不存在大量双螺旋DNA的交换，而是有许多其它引发重组的方式。一些情况下，DNA以游离单链3末端的形式被用于重组，如DNA的辐射损伤可产生单链，噬菌体基因组经滚环式复制也能产生大量单链。 研究发现在噬菌体的一些突变体中单一碱基对的改变就能产生激发重组的

12、一些位点，如Chi位点。这些位点都含有一个恒定的非对称的8 bp序列（5-GCTGGTGG-3），该序列天然存在于E.coli 的DNA中，大约每510 kb长的序列中即可出现一次。,25,RecA蛋白 38kDa，与SSB一起结合于单链DNA形成螺旋纤丝。此复合物可与双链DNA作用发生部分解旋以便识别碱基，迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋，从而转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来。,26,RecA有两个主要功能： 诱发SOS反应； 促进DNA单链与同源双链发生链交换，使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得

13、以进行。 当Rec A与 DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上形成螺旋状纤丝。,27,Ruv AB复合物结合在Holldiay中间体,Ruv蛋白 由于DNA分子是螺旋结构，在持续进行链交换时要发生分子旋转。Ruv A和 Ruv B蛋白共同构成了DNA解旋酶。 RuvA四聚体有平面对称的四方形结构，能识别 Holliday中间体的交叉点，RuvB利用其ATP酶的水解活性而驱动DNA解螺旋和分支移动，在移动的后方又重新形成螺旋。,28,RuvC蛋白 RuvC蛋白是一种核酸内切酶，同源重组最后由 RuvC将 Holliday联结体切开，并由 DNApol和 DNA连接酶修复合成。 Ru

14、vC特异识别Holliday联结体并将其切开，它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定重组结果是片段重组体还是拼接重组体，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。,29,Holliday模型缺陷： 重组的两个DNA在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。 但一般单链断裂经常发生，两个分子在同位置发生断裂几率有限。,30,Moselson认为同源分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一分子同源区，造成链置换。侵入链留下的缺口由聚合酶补上，被替代的链被降解，它的残留末端与最初断链连接，形成中间体。,31,更多研究表明，重组由双链断裂启动，两同

15、源分子之一发生双链断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具3末端单链，它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应链则被置换，与原断裂链配对。 经修复合成、链的再连接，形成两个交叉，而非单链交换的一个交叉。,32,只有当两条DNA有75 bp以上同源区时，才发生同源重组，小于此值，重组率显著降低 同源性并不意味序列完全相同。两DNA只要含有一段碱基序列类似的同源区，就可发生重组。 现在认为， DNA双链断裂才能与同源分子发生链交换，将同源染色体分配到子代细胞，同源重组是减数分裂的原因，而非结果。 因此双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。,33,相当于原核中与重组有关酶的对应物在真核中也已

16、发现。 酿酒酵母的rad 51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者功能相关。 该基因的突变造成双链断裂积累，且无法形成正常的联合复合物，但此蛋白不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核与真核的同源重组机制可能不同。,34,特异位点重组 广泛存在于各类细胞，有关主要过程： 某些基因表达的调节； 发育过程中程序性DNA重排； 有些病毒和质粒复制中发生的整合与切除。 特点： 1）一般发生在特定短序列（重组位点）， （20200 bp）内。 2）有特异酶（重组酶）和辅因子识别作用。,35,特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向： 重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位； 重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除； 重组位点在不同分子上，重组发生整合。,36,重组位点方向相反的 存在于同一DNA分子 重组结果发生倒位； 【原来的两个位