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1、1 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I DIG High Prime DNA 标记标记及杂交及杂交检测试剂盒检测试剂盒 I 说明书版本：Version11 （2010 年 8 月） 利用随机引物法及 DIG-dUTP（碱不稳定）进行 DNA 标记反应，采用酶联免疫方法及发色底 物 NBT/BCIP 进行杂交分子的显色。 本试剂盒可对 10ng-3g DNA 进行 12 次标记反应，可进行 24 次杂交检测反应（100cm2杂 交膜） 。 产品目录号：11 745 832 910 试剂盒于-15 -25保存 2 1. 概
2、况概况 1.1 说明书内容说明书内容 1. 概况概况 2 1.1 说明书内容2 1.2 试剂盒组成3 2. 介绍介绍 4 2.1 产品概述4 3. 实验步骤和需要的材料实验步骤和需要的材料7 3.1 实验开始前准备7 3.2 DIG-DNA 标记7 3.3 定量标记反应效率10 3.4 DNA 转膜和固定12 3.5 杂交 13 3.6 免疫检测14 3.7 探针洗脱和重探16 4. 结果结果17 4.1 典型结果17 5 附录附录 18 5.1 疑难问题解决18 5.2 参考文献18 3 1.2 试剂盒组成试剂盒组成 管管/瓶号瓶号 标签标签 成分及成分及功能功能 1 DIG-High Pr
3、ime 50l，用于 DNA 的随机引物法高效标记，即用 5标记反应液，含浓度优化的随机引物、核苷酸、 DIG-dUTP（碱不稳定） 、Klenow 酶及缓冲液。 澄清的粘性溶液 2 DIG-labeled Control DNA 20l，用于确定反应标记效率 pBR328DNA (5g/ml ,BamHI 线性化处理) 澄清溶液 3 DNA Dilution Buffer 31ml 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA（含 50g/ml 鱼精， pH8.0, 25) 澄清溶液 4 Anti-Digoxigenin-AP Conjugate 100l 750U/ml，Fab 片段，羊
4、源，结合了碱性磷酸酶 澄清溶液 5 NBT/BCIP 61ml,碱性磷酸酶显色底物 50储液18.75 mg/ml NBT，9.4 mg/ml BCIP，67% （v/v）DMSO 澄清溶液，颜色呈黄色或棕色 6 Blocking solution 4100ml 10储液 黄色，粘性溶液 7 DIG Easy Hyb Granules 可制备成 4 100ml 溶液，见 P13 杂交液 杂交反应所需的仪器和其他反应试剂杂交反应所需的仪器和其他反应试剂 请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂，参见下表： （本说明书） 杂交操作（本说明书） 杂交操作 步骤步骤 设备设备 试剂试剂
5、3.2 DIG-DNA 标记 水浴设备 水，PCR 级别 0.2M EDTA（pH8.0)，灭菌 3.3 定量标记反应效率 带正电荷的尼龙膜* DIG Wash and Block Buffer Set* TE 缓冲液 或 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 TE 缓冲液 4 3.4 DNA 转膜和固定 紫外交联设备 2 SSC 或 10 SSC 3.5 杂交 带正电荷的尼龙膜* 杂交袋* 或 耐热的封闭塑料袋或杂交滚筒瓶 注意注意：使用 DIG Easy Hyb 作为杂交 缓冲液时，不可用开口托盘 3.6 免疫检测 与杂交膜大小相适的容器 杂交袋* DIG Wash and Block B
6、uffer Set* TE 缓冲液 或 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 TE 缓冲液 3.7 探针洗脱和重探 大托盘 水浴设备 10 SSC 10%SDS 0.2M NaOH 带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。 2. 介绍介绍 2.1 产品概述产品概述 反应原理反应原理 DIG High Prime DNA 标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行 DNA 标记， 所获得的探针用于后续的杂交反应， 带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行 显色检测。 步骤步骤 描述描述 DNA 标记标记 利用随机引物法和地高辛标记的核苷酸对 DNA 进行标记，获得探针。DIG-
7、High Prime 为优化的 5 预混反应液， 包含地高辛标记的 核苷酸 DIG-dUTP（碱不稳定） ，随机引物及 标记级别的酶等。 杂交杂交 采用标准反应方法，DIG 标记探针可以与固 定在膜上的核酸进行杂交。碱不稳定的 DIG-11-dUTP 标记形式， 可使杂交子中的 DIG 更加容易和有效地被洗脱，固定在膜上的核 酸可以与其他 DIG 标记探针再次杂交。 免疫检测免疫检测 杂交子中的DIG通过anti-DIG-AP抗体进行免 疫检测， 并通过发色底物 NBT/BCIP 进行结果 显色。 5 应用应用 DIG 标记的 DNA 探针可用于： 所有形式的膜杂交反应 （微生物，人类，植物等
8、）基因组 DNA 中的单拷贝基因检测 样本样本 大小在 100bp 以上的 DNA 片段 线性化质粒，粘粒或 DNA 超螺旋 DNA 分析时间分析时间 步骤步骤 反应时间反应时间 DNA 标记 1h-过夜反应 杂交 6h-过夜反应 免疫检测 1.5h 结果显色 0.5-16h 试剂盒反应次数试剂盒反应次数 本试剂盒包含 对 10ng-3g DNA 进行 12 次标记反应 24 次杂交检测反应（100cm2杂交膜） 质量控制质量控制 对 DNA 对照品（pBR328，未标记）进行标准标记反应，将 0.1pg 同源 DNA 点膜后进行斑 点杂交， 显色 16h 呈阳性检测结果 （1pg 同源 DN
9、A 的杂交反应显色 1h 后呈阳性检测结果） 。 试剂盒保存试剂盒保存/稳定性稳定性 未开启的试剂盒可在-15 -25下稳定保存至产品有效期限，具体日期请见试剂标签说明。 试剂盒需在干冰条件下运输。 试剂盒开启后，不同的试剂盒组分请在下表所列的条件下保存： 试剂盒组分试剂盒组分 保存保存 Anti-Digoxigenin-AP Conjugate （管号 4） 2 8，可稳定保存 NBT/BCIP（管号 5） 2 8，可稳定保存 6 15 25条件下可稳定保存 1 月 注意注意：在干冰运输过程中，本试剂可能产生 沉淀物质，请将试剂在 37条件下温育以溶 解沉淀物。 Blocking solut
10、ion （瓶号 6） 未开启时，在 15 25条件下稳定 开启后，请将母液分装，于 2 8或 15 25条件下保存，在保证无菌的情况下可稳 定保存 1 月 每次实验，请新鲜配制工作液 灵敏度和特异性灵敏度和特异性 1g 人胎盘 DNA 酶切消化后，进行 Southern blot 检测，可检出人单拷贝基因。 注意：注意：试剂盒检测灵敏度决定于杂交实验中标记 DNA 的使用浓度，以及显色反应时间。 优势优势 实验实验优势优势 试剂盒特性试剂盒特性 准确、快速 DIG-High Prime 为高效预混反应液，减少手工步骤的同时，增加标记 核酸的得率和标记反应重复性 灵敏度高 在人和植物等复杂基因组
11、中可检出单拷贝基因 节省试验时间 DIG 标记的探针可稳定保存至少一年。杂交反应时，杂交液可重复使 用 35 次（根据每次杂交反应中消耗的探针量决定重复使用次数） 。 7 3. 实验步骤和需要的材料实验步骤和需要的材料 3.1 实验开始前准备实验开始前准备 实验操作建议实验操作建议 建议建议 指导指导 请在洁净条件下进行实验 将杂交检测溶液进行灭菌处理 含 SDS 的溶液过滤除菌 将 Tween 20 加入到经灭菌的溶液 使用洁净的孵育容器 所有孵育容器在使用前经严格洗涤和漂洗 膜操作要求 戴无粉手套进行操作 使用洁净的镊子，仅对膜的边缘进行操作 实验步骤实验步骤 3.2 DIG-DNA 标记
12、 3.3 定量标记反应效率 3.4 DNA 转膜和固定 3.5 杂交 3.6 免疫检测 3.7 探针洗脱和重探 3.2 DIG-DNA 标记标记 反应原理反应原理 利用随机引物法和地高辛标记的核苷酸 DIG-11-dUTP 对 DNA 进行标记， 获得探针。 DIG-High Prime 为优化的 5 预混反应液，包括含 DIG-dUTP（碱不稳定）的 dNTP 混合液，随机引物， 标记级别的 Klenow 酶和优化的反应缓冲液。 反应所需的仪器和其他试剂反应所需的仪器和其他试剂 水浴设备 冰或冰水浴 试剂试剂 成成分分 保存条件保存条件 用途用途 水 水，PCR 级别 15 25，可稳定保存
13、 DNA 稀释 EDTA 0.2M EDTA，pH8.0 15 25，可稳定保存 终止标记反应 8 DNA 模板模板 请见下表的 DNA 模板建议 模板特性模板特性 具体建议具体建议 纯度 使用 High Pure Plasmid Isolation Kit*进行质粒 DNA 纯化。如使用其他商 业化试剂盒进行质粒纯化，建议在反应后进行酚/氯仿抽提，去除残留蛋 白。如模板经限制性酶切或其他修饰酶处理，在进行标记反应前应进行 酚/氯仿抽提，去除残留蛋白。 片段大小 为获得最佳标记结果，建议将 DNA 模板线性化处理，模板片段长度至少 100bp。 如 DNA 模板5kb， 使用 4bp 切口的限
14、制性内切酶进行酶切处理。 模板浓度 使用下述步骤可成功标记 10ng-3g 的 DNA 模板。请根据具体的杂交 反应确定您将使用的探针量。 如需检测复杂基因组中的单拷贝基因，建议至少使用 300ng DNA 模板 进行标记反应，杂交反应时探针浓度采用 25ng/ml。 标记反应的试剂用量和反应体积可成比放大，以制备大量探针。 凝胶中回收凝胶中回收 DNA 模板模板 如果您进行的是基因组 Southern blotting 实验，应通过凝胶电泳将质粒中插入的模板 DNA 进行切胶回收。建议使用 High Pure PCR Product Purification Kit*或 Agarose Gel DNA Extraction Kit*，获得更好的 DNA 回收结果。 反应步骤反应步骤 下述步骤用于
