chip_原理及实验方法

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1、染色质免疫沉淀技术（染色质免疫沉淀技术（ChIPChIP）实验方法）实验方法 实验原理 染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和 PCR 技术，在体 内检测与特异蛋白质结合的 DNA 片段。ChIP 技术最大的优点就是在活体细胞状 态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞 中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超 声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段 把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用 PCR 等方法检测鉴定共沉淀的 DNA 片 段的特性。 仪器和试剂 真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离

2、心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M 甘氨酸，ddH2O，剪切的鲑精 DNA/protein A 琼脂糖珠(Sant cruz)， 蛋白酶 K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水 乙醇, 提取缓冲液 1（EB1）:0.4M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM -ME； 0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、 Antipain、TPCK、Benzamidine） 提取缓冲液 2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10

3、mM MgCl2； 1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ；5mM -ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 提取缓冲液 3（EB3）：1.7M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X- 100；2mM MgCl2；5mM-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF 和 蛋白酶抑制剂混合物（同上） ChIP 稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM Tri

4、s-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物（同上） 洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配） 低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris- HCl，pH8.0 高盐洗脱液：500mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris- HCl，pH8.0 LiCl 洗脱液：0.25M LiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mM EDTA；20mM Tris- HCl，pH8.0 TE 缓冲液：1mM EDTA；10m

5、M Tris-HCl，pH8.0 实验方法 植物材料的准备（以拟南芥为例） 1在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。 2约 3 周后，在 50ml 管中收集 1.5g 的幼苗，无菌水洗 2 次。 甲醛固定 4室温下把幼苗浸在 37ml 含 1%的甲醛的 EB1 液中，抽真空 10min。 5加入 2M 甘氨酸使终浓度至 0.125M，中止反应，继续抽真空 5min，此时幼苗 应该变为半透明。(加 2M 甘氨酸约 2.5ml) 6用 40ml 水洗幼苗 3-4 遍。 7去除幼苗水分，将幼苗液氮冷冻-80保存或继续进行下面操作。 分离和超声染色质（注：除特殊注明，所有操作都在 4进行） 8液氮预冷

6、研钵和杵子，液氮研磨幼苗成粉末状。 9在 50ml 管中加入 30ml EB1 悬浮组织。(此时，EB1 中不含甲醛) 104 层 miracloth 过滤组织到一个新的 50ml 管中。 114，2880g 离心 20min。 12小心去上清，1ml EB2 重悬沉淀。 13转移至一个新的 1.5ml 离心管。 144，12000g 离心 10min。 15300ul EB3 重悬沉淀。 16转入另一已加入 300ul EB3 新管中。 174，16000g 离心 1 小时。 18去上清，300ul NLB 重悬沉淀（4操作），涡旋，用枪头吹打，保留 10ul 溶液做后续检测。（在上胶前，该

7、溶液按下面 DNA 解交联的操作步骤一样） 19超声波处理溶液，打断 DNA 成约 0.5-2kb 的 DNA 片段。打断的染色质可以- 80保存，或进行后续操作。 免疫沉淀 204，16000g 离心 5min 沉淀碎片。 21转移上清到一个新管。保留 10ul 溶液去检测超声效率（按第 35 步往后处 理）做后续检测 (以第 18 步保留的溶液做对照，电泳检测 DNA 片段的长 度)。 22分 200ul 到 2 个新管，每管 100ul。 23每管加 900ul ChIP 稀释液，使 SDS 浓度变为 0.1%SDS。 24每个样品加 440ul 剪切的鲑精 DNA /蛋白 A 琼脂糖珠

8、（用前，珠必须洗 3 次，然后重悬于 ChIP 稀释液中），4，轻轻晃动 1 小时。（注：鲑精 DNA /蛋白 A 琼脂糖珠的用量需要根据购买的产品质量进行调整） 254，16000g 离心 2min。 26合并 2 管上清（约 2ml），分装 2ml 到 3 个 EP 管中（每管 666ul）。 27加 4ul 抗体到其中的 2 管中，另一管作为阴性对照。 284过夜，并轻轻晃动。 29再加 440ul 剪切的鲑精 DNA /蛋白 A 琼脂糖珠（事先用 ChIP 稀释液洗涤 处理），4轻微晃动 1 小时，收集免疫沉淀。 30准备新鲜的洗脱缓冲液（1%SDS，0.1M NaHCO3，现配）。

9、314，16000g 离心 2min，取沉淀，每次 1ml 洗脱液洗沉淀 10min。洗脱液 顺序如下： （1） 低盐洗脱液 1 次 （2） 高盐洗脱液 1 次 （3） LiCl 洗脱液 1 次 （4） TE 缓冲液 2 次 最后，去除 TE 缓冲液。 洗脱和染色质的解交联 32加 250ul 新鲜的洗脱缓冲液（第 30 步已准备）到沉淀珠中，以释放和珠结 合复合物。 33混匀，65水浴 15min，轻微晃动。 34小心取上清转移到新管，重复洗涤珠，合并 2 次洗液。 35加 20ul 5M NaCl，65孵育过夜，以解染色质的固定。 36加 10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tr

10、is-HCl，pH6.5，和 1.5ul 14mg/ml 的蛋 白酶 K，65温育 1 小时。 37等体积酚/氯仿抽提 DNA，在有 novagen pellet paint 存在的情况下乙醇 沉淀 DNA，70%乙醇洗沉淀。 38用 40-50ulTE 缓冲液（含 10ug/mlRNase A）溶解 DNA。纯化的 DNA 片段可 用于 PCR 扩增检测目的基因，或者可用多重 PCR 来鉴定目的基因的有无 （与内参对照）。 39在 25ulPCR 体系中，模板加 0.5ul。模板的变化依赖于免疫沉淀的效果。 附：剪切的鲑精 DNA /蛋白 A 琼脂糖珠混合物（1M Tris-HCl，pH6.

11、5；5MNaCl； 0.5M EDTA，65加热封闭）（玻璃珠规格：212- to 300-um diameter; sigma） 制备方法： 1制备100ml灭菌TE（10 mM Tris，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0） 2结合：50mgBSA（做稀释抗体用）；0.5ml叠氮化钠（从5%的储存液中吸取）， 补充TE到47.5ml，0.2 u 滤膜过滤（溶液II）。 3用15ml灭菌TE洗20ml蛋白A珠（50% slurry）2次。 4结合：10ml protein A，4mg剪切的ssDNA，20ml灭菌的溶液II，4振摇45 分钟。 5分装4保存 注意事项： 1材料固定

12、要充分，使其全部沉到底部。抽气后在冰上固定半小时，固定时间 勿太长，否则可能会影响之后的抗体结合。 216 步中重悬物轻轻滴加在另一新管中的 EB3 上。 319 步中超声条件根据不同材料调整，如 100W, 超声 10 秒，间隔 15 秒，超 声 4 次。 424 步中洗蛋白 A 琼脂糖珠时可将琼脂糖珠轻轻弹开，混合均匀，以便充分 洗涤。 531 步中洗脱过程中也要轻轻弹开琼脂糖珠。 参考文献： Chris Bowler, Giovanna Benvenuto, Pierre Laflamme, Diana Molino, Aline V. Probst, Muhammad Tariq an

13、d Jerzy Paszkowski，Chromatin techniques for plant cells，The Plant Journal (2004) 39, 776789 染色质 免疫 沉淀（ChIP）技术 的难点及 应用 柴晶晶 博士 序言 随着人类 基因 组测序工作的基本完成，功能基因组学的 研究 逐渐成为研究的热点。而基 因 表达 的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个 蛋白 因子的调控功能， 可以通过对蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白数量（过表达 Overexpression 或基因缺 陷型 Knockout）, 以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白 Dominant

14、-negative mutation）的控制，影 响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片（cDNA Microarray），抑制消 减杂交（Suppression Subtractive Hybridization），差异显示 RT-PCR等方法进行研究1。然 而这些方法都无法提供证据证明这些变化是受某个蛋白因子直接调节的，还是间接的其他 变化导致的 结果 。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接 检测蛋白质 -DNA 的相互作用。传统的方法包括转录因子结合 实验 （Transcription Factor Assay），电泳 迁 移率变动分析（electrophoret

15、ic mobility shift assay），DNase I 足印法（DNase I footprinting），酵母单杂交 系统 等。但这些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情 况下 DNA 与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的 动态瞬时事件2。 染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称 ChIP）是研究体内蛋白质与 DNA 相互作用的一种技术。它利用抗原 抗体 反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因 子与基因组 DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围 已经从研究目的蛋白与已知靶

16、 序列 间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未 知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与 DNA 的相互作用，发展到研究两个蛋白与 DNA 共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在 DNA 序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于 科研的各个领域。目前已经有成熟的 ChIP试剂 盒出售，如 Millipore 公司提供的 EZ-ChIP 试剂盒，使得越来越多的研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域取得了成功。 ChIP 技术的 原理 染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把 细胞 内的 DNA 与蛋白质交联在一起，通 过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白 相结合的 DNA 片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染 色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的 纯化