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1、,一、限制性核酸内切酶 二、连接酶 三、聚合酶 四、修饰酶,基因的剪刀,-限制性内切酶,第一节 限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme),核酸酶（P41-42)：切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。可分为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。 按水解断裂核酸分子的不同方式分： 核酸外切酶：以核酸的末端为酶解部位逐个降解核苷酸 核酸内切酶：从核酸内部水解磷酸二酯键使之断裂 限制性核酸内 切酶，简称限制酶,一. 限制与修饰发展史: 1962年 Arber, W. (瑞士) 等 提出限制与修饰假说。 1968 Meselson和Yuan 发现型限制性酶
2、。 1968 Smith和Wilcox 发现了类限制性酶并阐明其性质。 1971 Nathans等首次制作酶切图谱。 因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。,1962 , Arber, 1968 Smith等发现限制性酶,W. Arber (1929 ) H. O. Smith (1931 ) Biozentrum der Universitt Basel, Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA,寄主控制的限制与修饰作用：,感染过A菌的噬菌体进入B几乎总是被切成小片断的现象，
3、称限制。 寄主使它再次感染时能够有效生长而没有收到限制的现象，称修饰。,二.限制性内切酶的类型（P44）,基因工程中最常用的是型酶,二. 型酶的命名,书写与剪切方式： 限制酶 来源 剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 GAATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCAG Bse Bacilus stearothermophilus strain 822 (Hpa) GTTAAC EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序),Cla Nco Nde Not Sac Xba Xho ,有些内切酶来源于无菌株名的细菌,型
4、内切酶识别位点序列中心对称,5 G A A T T C 3,3 C T T A A G 5,EcoR ,酶切位点及酶切未端,平未端,5 G A T A T C 3,3 C T A T A G 5,EcoR ,5 G A T A T C 3,3 C T A T A G 5,EcoR (5 GAT ATC 3) Hinc (5 GT(T/C) (A/G)AC 3) Hind (5 GT(T/C) (A/G)AC 3) Sca (5 AGT ACT 3) Sma (5 CCC GGG 3),具5突出未端的粘性未端,5 G A A T T C 3,3 C T T A A G 5,5 G 3 5 A A
5、 T T C 3,3 C T T A A 5 3 G 5,EcoR ,BamH (5 G GATCC 3) EcoR (5 G AATTC 3) Hind (5 A AGCTT 3) Nco (5 C CATGG 3) Nde (5 CA TATG 3) Not (5 GC GGCCGC 3) Sal (5 G TCGAC 3) Xba (5 T CTAGA 3) Xho (5 C TCGAG 3),具3突出未端的粘性未端,5 G A G C T C 3,3 C T C G A G 5,5 G A G C T 3 5 C 3,3 C 5 3 T C G A G 5,Sac ,Kpn (5 GG
6、TAC C 3) Pst (5 CTGCA G 3) Sac (5 GAGCT C 3),识别同一序列且在同一位置(有时不)切割DNA的内切酶称为同裂酶 Hinc (5 GT(T/C) (A/G)AC 3) Hind (5 GT(T/C) (A/G)AC 3) Sma (5 CCC GGG 3) Xma (5 C CCGGG 3),同裂酶,来源和识别都不同，但酶切产生相同末端的内切酶称为同尾酶 专指产生粘性未端的内切酶,同尾酶,5 G G A T C C 3,3 C C T A G G 5,BamH ,5 G 3,3 C C T A G 5,5 A G A T C T 3,3 T C T A
7、G A 5,Bgl ,5 G A T C T 3,3 A 5,T4 DNA Ligase,5 G,3 C C T A G,G A T C T 3,A 5,连接处不再是内切酶识别序列,BamH / Bgl Sal / Xho Spe / Xba ,三、限制酶的识别序列与DNA的切割（P47）,1、限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性； 2、限制酶识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可以从理论上推导酶切DNA片段的大小； 作用于同一种DNA分子，识别序列短的出现概率大，酶切DNA片段小。 识别位点： 4个碱基：44 = 256 6个碱基：46 = 4096,3、限制酶识别序列
8、的相邻序列效应（P48）：即大多数限制性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸没有催化活性，需在两侧各延长一个或几个核苷酸才能被有效酶切。 应用：设计引物时加保护碱基。,4、限制酶的位点偏爱性(p48):限制性核酸酶的切割效率与酶切位点侧翼序列的核苷酸组成有关。 这是一些限制性内切酶酶切效率不高的原因。例如：在实验过程中，经常会发现HindIII、XbaI等酶活性较低。 应用：涉及局部消化时应考虑使用这些酶。例如，构建基因组文库时，需要对基因组DNA进行不完全酶切。,5、星活性(P48),正常条件下EcoR 识别5-GAATTC-3, 当处于低盐(8.0)或高甘油(50%)时识别5-AATT-3； 星
9、活性是指某些限制性核酸内切酶在不适的环境中其识别序列发生改变的现象。,四. 影响限制性核酸内切酶活性的因素(P49),1 底物DNA的纯度,在DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切酶的活性。,解决办法： A. 增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 B扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应的稀释。 C延长酶催化反应的保温时间。,2 底物DNA的甲基化程度 解决办法： 更换缺失了甲基化酶的菌株 选择同裂酶,3 酶切消化反应的温度 一般内切酶的反应温度为37
10、特例：Sma I: 25 Taq I: 65 Mae I: 45,4 酶切缓冲液 成分：MgCl2、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清蛋白（BSA） 酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。Tris-HCl的作用，在于使反应混合物的PH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。 疏基试剂对于保持某些限制酶的稳定性可能是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。 有一部分限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而一部分限制酶则可适应较广的离子强度变化幅度。 操作中注意事项： 合适的温度； 内切酶的用量不超酶切总体积的1/10,酶切反应,酶
11、 (多数已商品化, 以10u/l溶液形式提供) 反应缓冲液 (以5倍或10倍母液随酶提供) 反应时间: 随DNA及酶用量而定, 一般数小时至过夜,第二节 DNA连接酶,核酸酶是“剪刀” 连接酶就是“浆糊”、“胶水”,一.连接酶 (DNA ligase) 在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA 中相邻的3-OH和5-P之间形成磷酸二脂键。(P51),连接酶的功能： (1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口 (2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口； DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。 用途
12、： (1)通过粘端连接DNA分子； (2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,DNA连接酶的发现 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。 这种酶需要在一条DNA链的3，末端具有一个游离的羟基(OH)，和在另一条DNA链的5，末端具有一个磷酸基团(P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用,在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP腺苷三磷酸作能源。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。,分类： 用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶。 另一种是由大肠杆菌T
