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1、,微生物学检验,第八章 革兰阴性需氧和兼性厌氧杆菌鉴定,返回总目录,本 章 内 容,学习目标及重点,学习目标： 1掌握：肠杆菌科的共性及常见细菌的微生物检验；非发酵菌革兰阴性杆菌的共同特性；铜绿假单胞菌生物学性状、微生物学检查及临床意义;霍乱弧菌主要生物学特性；临床常见革兰阴性苛养菌的微生物学检验方法 2熟悉：肠杆菌科细菌的临床意义；不动杆菌属和产碱杆菌属生物学性状、微生物学检查及临床意义；霍乱弧菌微生物常规检验程序和方法 3了解：莫拉菌属等其他非发酵革兰阴性杆菌生物学性状、微生物学检查及临床意义；副溶血性弧菌的主要生物学特性，微生物学常规检验方法；临床常见革兰阴性苛养菌的生物学特性 1.肠杆
2、菌科常见菌属的鉴定、血清学诊断，与非发酵菌、弧菌科的鉴别 2.铜绿假单胞菌、霍乱弧菌鉴定要点,本章重点：,第一节 肠杆菌科,概 述 是栖居在人和动物的肠道内的一大群形态、生物学性状相似的革兰阴性杆菌 通过粪口途径进行传播，引起肠道感染或肠外感染 广泛分布在自然界中，包括植物、土壤、水以及人和动物的肠道中，多数是正常人肠道菌群的正常菌群，可引起医院感染。条件致病菌临床可查到四十种以上,肠杆菌科细菌包括： 埃希菌属 志贺菌属 沙门菌属 耶尔森菌属 变形杆菌属 克雷伯菌属 摩根菌属 枸橼酸菌属 肠杆菌属 沙雷菌属等,第一节 肠杆菌科,肠杆菌科共同特点,形态结构 G-小杆菌，无芽孢，多数有鞭毛及菌毛
3、培养特性 需氧或兼性厌氧 营养要求不高，普通培养基可生长，菌落相似，形成灰白色中等大小,S型菌落，常用肠道选择培养基培养 氧化酶阴性，发酵葡萄糖，硝酸盐还原实验阳性,第一节 肠杆菌科,肠杆菌科细菌鞭毛染色及电镜下形态,第一节 肠杆菌科,EMB（伊红美兰培养基）,第一节 肠杆菌科,SS培养基（沙门志贺培养基） （含营养物、鉴别乳糖、中性红指示剂、胆盐、煌绿等抑制剂）,伤寒沙门菌 无色乳糖不发酵菌落,第一节 肠杆菌科,生化反应: 活跃，常用于鉴别肠道杆菌。发酵葡萄糖产酸或产酸产气，氧化酶（-），触媒（+），还原硝酸盐 抵抗力：不强。耐受胆盐，抵抗多种染料的抑菌作用 抗原结构: 菌体（O）抗原 鞭毛
4、（H）抗原 表面（K、Vi）抗原 易出现各种变异：耐药性（重要）,第一节 肠杆菌科,初步鉴定到科的特征,葡萄糖发酵（+） 硝酸盐还原（+） 氧化酶（-） 触酶（+）痢疾志贺菌除外 结合血清学鉴定到属、种（型）,硝酸盐还原试验 阳性：红色 阴性：淡黄色,氧化酶试验 阳性：紫红色 阴性：无色,第一节 肠杆菌科,一、埃希菌属（Escherichia）,大肠埃希菌镜下形态（上革兰染色、鞭毛染色，下电镜观察）,(一）生物学特性,形态染色：符合肠杆菌特点，周鞭毛菌，有菌毛 培养特性：符合肠杆菌特点 EMB紫黑色有金属光泽 S-S桃红色 生化反应：IMViC（+-）,见教材表格。 抗原 O 抗原（ O1-O
5、173） H 抗原（H1-H56） K 抗原（K1-K100） 血清型表示法：O：K：H20,大肠埃希菌菌落特征（MAC）,EMB平板上的E.coli,(一）生物学特性,大肠埃希菌KIA（AA）MIU（）,(一）生物学特性,大肠埃希菌IMViC试验（） 右侧为对照（）,(一）生物学特性,埃希菌属鉴定特征,靛基质（+） 甲基红（+） 枸橼酸盐（-） 尿素（-） 发酵多种糖产酸产气,肠杆菌科与其它革兰阴性杆菌区别,（二）临床意义,1.致病物质 除内毒素、荚膜肠杆菌科共有的毒力因子外，大肠埃希菌具有独特的毒力因子有： 黏附素具有高度特异性 吸附、定植、致病 外毒素（由ETEC产生的肠毒素） 不耐热肠
6、毒素（heat labile toxin，LT），加热 65、30分钟即被破坏； 耐热肠毒素（heat stable toxin，ST），100、20分钟仍不被破坏，LT和ST均可使肠道细胞中cAMP的水平升高，引起肠液大量分泌而导致腹泻,2.所致疾病： 肠道外感染（内源性感染） 1.化脓性感染定位转移 腹膜炎、阑尾炎、创伤感染、手术刀口感染、肺炎、败血症、新生儿脑膜炎等 2.泌尿道感染病原菌来自病人肠道（上行性） 占泌尿道感染首位、女性多见（尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎等）,（二）临床意义,引起肠道感染的大肠埃希菌的主要致病特征,耐药性,耐药性越来越严重：产超广谱-内酰胺酶（ESBL)比例增高，
7、对青霉素类和14代头孢菌素及单环菌素耐药，仅对头霉素类、碳青霉烯类、含酶抑制剂类抗生素敏感。,（三）微生物学检验,肠道外感染 标本涂片、染色分离培养鉴定 尿路感染时每ml尿含菌10万，有诊断价值 肠道内感染 用弱选择性培养基 分离培养+生化反应+血清分型+毒素测定+核酸检测等,大肠埃希菌检验程序,1）ETEC 生化反应加血清分型加肠毒素测定 2）EPEC 生化反应加血清分型，用多价抗血清检测其O抗原 3）EIEC 生化反应血清分型加毒素测定 4）EHEC 血清分型加生化反应,各个血清型的鉴定,二、沙门菌属,是肠杆菌科中最复杂的菌属，有2000种以上血清型，对人类有致病性。 肠热症伤寒沙门菌，甲
8、型副伤寒沙门菌、乙型伤寒沙门菌、丙型伤寒沙门菌 食物中毒鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌 败血症猪霍乱沙门菌最常见,（一）生物学性状,形态染色符合肠杆菌特点，多为周毛菌，有菌毛,伤寒沙门菌菌落特征（SS）,培养特点无色细小菌落。有些能产生硫化氢的菌株，在SS琼脂上形成中心黑色的菌落,生化反应 乳糖（-），葡萄糖（+）/+，多数H2S+，动力+，尿素（-），甲基红（+），枸橼酸盐利用（+），赖氨酸脱羧酶（+），产酸产气,伤寒沙门菌KIA结果 （K A）MIU（）,沙门菌IMViC试验（）,（一）生物学性状,抗原结构 O抗原特异性低、稳定、分群（组） H抗原特异性高，不稳定，分型 Vi抗原（
9、毒力抗原）不稳定，可阻止“O”凝集 抵抗力：不强,（一）生物学性状,肠热症 临床过程 潜伏期2周 发病初期： 第1W（第一次菌血症）、高热、肝脾肿大、皮疹、WBC等全身中毒症状，此期血液（80%）、骨髓90% （+）有大量细菌,（二）临床意义,菌毛,穿入淋巴液,胸导管,第二次菌血症,迟发型变态反应 肠壁坏死、溃疡,高热、肝脾肿大、玫瑰疹、白细胞等全身中毒症状,肠热症发病机制,伤寒沙门菌等经口,吸附小肠黏膜细胞上,在肠壁、肠系膜淋巴组织中繁殖（致敏）,血流（第一次菌血症）,肠出血、肠穿孔,胃肠炎（食物中毒） 潜伏期短，624小时，起病急，病程短24天， 发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻 败血症 经口
10、感染，经肠道入血，败血症症状明显而 肠道症状不明显 带菌者 健康带菌者，恢复期带菌者 免疫性 肠热症，病后免疫牢固，其它可重复感染,（二）临床意义,（三）微生物学检验,分离培养与鉴定 标本采取 肠热症：第12周，血；第23周，粪便、尿；全过程骨髓培养 食物中毒：粪便、呕吐物、可疑食物 败血症：血 带菌者：粪便 分离鉴定： 增菌（血、骨髓）EMB、SS生化反应血清鉴定,沙门菌检验程序,、,血清学诊断肥达反应（Widal）,-原理 用已知伤寒沙门氏菌O抗原及H抗原，以及引起副伤寒的沙门氏菌H抗原与待检血清作凝集试验，测定待检血清中有无相应抗体及其效价。（TO、TH、PA、PB） -方法：试管凝集法
11、（定量） -结果分析：TO80，TH160，PA、PB均80才有意义 -动态观察：双份血清抗体四倍升高有诊断意义,-临床意义 O抗体（IgM）， H抗体（IgG） O 、H抗体均升高，患伤寒的可能性大 O 、H抗体不升高，患伤寒的可能性小 只有H升高，则可能是预防接种过或非特异性回忆反应 只有O升高而H不高，则可能是感染早期或其他沙门菌的交叉反应,三、志贺菌（痢疾杆菌）,志贺菌形态特征,（一）生物学性状,形态染色 符合肠杆菌特征，有菌毛，无鞭毛，无动力是本菌与其它肠道致病菌主要区别点 培养特性 肠道鉴别培养基上的无色透明、乳糖不发酵菌落 生化反应 葡萄糖（+）、乳糖（-）（宋内志贺菌迟缓发酵乳
12、糖）、H2S（-）、尿素（-）、动力（-）,乳糖发酵实验,（一）生物学性状,未发酵,发酵,志贺菌KIA结果（KA）MIU（）,志贺菌IMViC试验结果（）,（一）生物学性状,抗原分类根据O抗原分4群，40余型 A群痢疾志贺菌（10） B群福氏志贺菌（13） C群鲍氏志贺菌（18） D群宋氏志贺菌（1） 抵抗力 比其它肠杆菌弱，尤其对酸敏感,（一）生物学性状,（二）致病性与免疫性,致病物质 侵袭力 菌毛：黏附肠黏膜上皮细胞 型分泌系统穿透上皮细胞并扩散、传播 内毒素 强烈内毒素，作用于局部并可吸附入血引起全身症状 外毒素A群（、型）产生志贺毒素（ST），有3种生物活性 （1）肠毒素：类似ETEC
13、毒素、霍乱肠毒素作用水样泻 （2）细胞毒性：对人肝细胞、肠黏膜细胞有毒性，引起变性坏死 （3）神经毒性：损伤动物神经系统（麻痹、死亡）,细菌（菌毛）吸附肠黏膜上皮细胞,穿入细胞并扩散周围及深入黏膜下层,释放内毒素、外毒素,肠局部 黏膜炎症 （变性、坏死、脱落） 出血、坏死、溃疡 脓血便/黏液血便,刺激肠壁植物神经 肠蠕动 肠肌痉挛 腺体分泌 水分吸收 腹痛、腹泻,刺激直肠肛门括约肌 里急后重 便数增加,吸收入血 发热、白细胞 高热、休克中毒性脑病、DIC,毒血症,中毒性菌痢,死亡,（二）致病性与免疫性,所致疾病细菌性痢疾 传染源：病人、带菌者 传播途径：经口 致病机制 临床类型 急性菌痢 中毒
14、性菌痢 慢性菌痢 带菌者 免疫力:不牢固，易再感染,（二）致病性与免疫性,（三）微生物学检验,在抗生素使用前采集新鲜粪便中脓、血、黏液部分，床边接种或立即送检，不能及时接种者可用卡-布运送培养基送检，昏迷不能排便病人可用肛拭取样。 微生物学检查 分离鉴定 毒力实验 快速诊断,志贺菌检验程序,四、克雷伯菌属（7个种）,(一）生物学特性 肺炎克雷伯菌（3个亚种）的肺炎亚种，与人类感染有关 G-球杆菌，无动力，有较厚的荚膜，多有菌毛 普通平板呈M型菌落（易拉成丝） 存在正常人体，目前为除大肠埃希菌以外最重要的条件致病菌,肺炎克雷伯菌革兰染色阴性杆菌，无动力,荚膜肿胀试验阳性,肺炎克雷伯菌的菌落特征（
15、左血琼脂平板，右MAC平板）,克雷伯菌属鉴别,菌落较大，黏稠，挑取时易拉成丝,肺炎克雷伯菌黏丝试验,肺炎克雷伯菌KIA（A A ）、MIU（）,肺炎克雷伯菌黏丝试验,肺炎克雷伯菌IMViC试验（）,肺炎克雷伯菌粘丝试验,克雷伯菌属的细菌多感染免疫力低下的人群，是医院感染中最重要的条件致病菌 肺炎克雷伯菌是临床标本中常见的细菌，可引起典型的原发性肺炎 该菌在正常人口咽部的带菌率为1%6%，在住院患者中可高达20%，是酒精中毒者、糖尿病和慢性阻塞性肺部疾病患者并发肺部感染的潜在的危险因素,（二）临床意义,所致疾病 肺炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症 肺炎克雷伯菌肺炎亚种还能引起各种肺外感染，包括肠炎和脑膜炎（婴儿），泌尿道感染（儿童和成人）及菌血症 近年在一些亚洲地区（特别是台湾和韩国）由肺炎克雷伯菌引起的肝脓肿等严重社区获得性侵袭性感染有上升的趋势,（二）临床意义,耐药性 对氨卞西林和羧卞西林天然耐药 肺炎克雷伯菌易产生超广谱-内酰胺酶（ESBL） 近年来文献报道我国产酶率已达30%左右，产酶株对青霉素类、第1、2、3代头孢菌素及单环-内酰胺类抗生素均产生耐药，而仅对头霉素类、碳青霉烯类及酶抑制剂敏感 ESBL检测现已作为医院细菌室常规
