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1、ADSCs的分离与纯化 关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用01的胶原酶在37下振荡消化4O90 min，再用含10胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。1 200 rmin离心510 min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按24105cm 接种于50ml培养瓶内。37条件5 的CO 饱和湿度培养箱内培养，2 d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70 8O融合时用025胰酶消化，并传代。
2、经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致 。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的 。流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95以上的细胞纯度 。ADSCs的生物学特性1.ADSCs的鉴定 在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，Eeadherin
3、，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。ADSCs分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGFB)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2 C。2.ADSCs的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复
4、、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、吲哚美辛及1一甲基一3异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCs向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPARr2、leptin(瘦素)、Glut4(葡萄糖转运蛋白等 。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂肪细胞形成的标志。 向血管内皮细胞分化：将ADSCs置于含甲基纤维素和血管内皮生长因子的半固体培养基中加以培养，镜下可见有分支状的管腔结构形成，免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记一CD31和vW 因子。Planat等描述了将培养3
5、d的ADSCs注入后肢缺血损伤的实验小鼠后肢肌肉中，15d以后给以血管造影及多普勒检查发现损伤后肢血供出现显著改善的实验结果 。 向成骨细胞分化: hADSCs在加入维生素C、B一磷酸甘油(BGP)和维生素D3的培养基中培养几代后，细胞表面形成的突起，其形态与体内的成骨细胞相似，用茜素红染色可见细胞内出现了钙小结” 。国外有将ADSCs作为种子细胞植入网状支架中，成功地修复狗的颅骨的报导 。国内马舟涌等 将获得的脂肪干细胞和进行成骨诱导后的脂肪干细胞分别种植在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架上，并移植到骨缺损模型中。实验证明，经诱导后的脂肪干细胞在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架中可以促进
6、骨骼愈合。这也间接证明了ADSCs的确向成骨细胞分化。 向软骨细胞分化：在体外，将维生素C、转化生长因子(TFG)、胰岛素添加到特定培养基里，可以定向诱导ADSCs向软骨细胞分化。结果在培养基里形成了细胞小结，经免疫组化分析得知，这些细胞小结表达型胶原纤维、硫酸软骨素、硫酸角质素等 。杨亚军等 用CDMPI体外诱导sD大鼠脂肪干细胞，结果诱导后的脂肪干细胞形态由长梭型向软骨细胞的多角形方向转变。免疫组化显示CDMPI诱导大鼠ADSCs后可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖(GAG)和型胶原，并进一步向软骨细胞方向分化增殖。 向心肌细胞分化：从脂肪组织中分离的脂肪基质血管组分(stromal vasc
7、ular fraction，SVF)即脂肪组织去除成熟脂肪细胞后，所获得的具有于细胞特性的基质细胞，直接种植在半固体的甲基纤维素培养基中，6d后，出现了各种不同的细胞形态，有成群的前脂肪细胞脂肪细胞，成纤维样细胞等等，1114d后，一些圆形的细胞开始了独立的收缩活动，在几天内，肌管样结构出现，并大量生长增殖，2030d后，局部出现了一簇有结合力的细胞群体，和有分支的纤维细胞共同结合在一起。在这期间，24d时，整个局部出现了单一节律的搏动。在分子水平上，这些搏动的细胞能表达几种心脏特有的mRNA，如转录因子，GATA一4和Nkx25，心室和心房肌凝蛋白轻链MLC一2v和MLC一2a，以及ANP(
8、心钠素)。这些数据表明了这些搏动细胞的心肌细胞特性 。 向神经细胞方向分化：国外一些研究人员用B一巯基乙醇(Bmercaptoethanol，BME)诱导hADSCs向神经细胞分化，30min后即出现类神经元样的细胞，3h后出现了神经元细胞表型，表达神经细胞早期阶段的标志性因子nestin、NSE、NeuN等 ，这证明了ADSCs能在体外分化为神经前体细胞，目前技术水平尚不能使之向成熟的神经元细胞或星型胶质细胞分化。ADSCs的临床应用前景展望 1.在组织工程中的应用应用组织工程有两种方案，一种是将种子细胞在体外接种于支架上培养，然后再进行移植；一种是将种子细胞与可降解材料复合物直接移植到体内
9、诱导目标组织形成。目前脂肪干细胞应用于临床仍处于动物实验阶段。有报道利用脂肪干细胞和支架成功地修复了骨缺损模型中犬的骨缺损 。 脂肪干细胞在修补受损伤的组织时与体外生物I型胶原支架材料的相容 脂肪干细胞具有增殖能力和多向分化潜能。对多种组织的损伤具有良好的修复作用。而且取材方便,是组织工程研究中的重要种子细胞之一。不同材料对细胞的生长、分化和黏附均有不同的影响,因而种子细胞能否在支架材料上良好生长,并表达自身特异性功能是目前组织工程研究的一个热点。 I型胶原支架材料与脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性，而且具有对细胞、组织等无毒性；不影响生物体的生长、增殖等功能。 有实验表明用体外生物I型胶原
10、支架材料与脂肪干细胞进行体外混合培养，证明了脂肪干细胞能在I型胶原支架材料上良好的附着、生长、增殖并在三维支架材料内保持均匀分布。故I型胶原支架可作为构建脂肪组织工程的细胞载体。I型胶原作为体外细胞培养支架时.有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用，是良好的培养粘附剂。其降解产物可被细胞利用合成新的基质。不产生毒性代谢产物，不影响内环境pH 值，因此不会影响细胞的生长增殖。胶原蛋白及相关制品已广泛应用于临床医学中，已被美国FDA 批准作为人工皮肤材料。 研究利用人脂肪干细胞作为种子细胞,进行体外细胞种植胶原支架。通过倒置显微镜和电镜观察细胞伸展、黏附和生长过程。镜下显示,种子细胞种植胶原材料后,生
11、长状态良好,无明显细胞毒性表现,在培养条件相对稳定的情况下.细胞可以进行正常增殖、迁移并分泌细胞外基质。通过检测.细胞与支架的黏附率达97%以上。说明该支架对细胞有良好的亲和性。 脂肪干细胞在骨组织中的应用 骨外伤、骨肿瘤和先天性畸形患者中常存在大面积的骨缺损。而修复材料的匮乏一直是临床面临的难题之一。传统骨修复的材料，如肋骨和髂嵴等自体骨，可获取的组织量有限。且对取材部位造成损伤：磷灰石和去矿化异体骨等异体材料，存在免疫排斥、疾病传染及骨溶解等问题。近年来，干细胞和骨组织工程研究的不断深人，为临床骨缺损的修复提供了新思路。脂肪干胞(Adiposederived stem cell,ADSC)
12、由于来源丰富且容易获取，体内、外实验均证实其能分化形成骨样组织，已成为骨组织工程的重要的种子细胞来源。而外国人Friedenstein将骨祖细胞分为确定性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC)和诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursorcells，IOPC)，确定性骨祖细胞是间充质细胞不能自发向成骨细胞转化，在一定的诱导因素后,才能向成骨细胞转化。由于脂肪干细胞来源稳定且含量丰富，在体内不经基因修饰或外源性生长因子刺激也能修复骨缺损，这使它在未来组织工程骨修复临床骨缺损的应用中备受关注。 但目前对脂肪干
13、细胞参与修复骨缺损的机制尚不清楚。研究表明间充质干细胞随着传代次数的增多而逐渐丧失其多向分化潜能。向脂肪细胞的分化能力只能维系10代以内，以后向成软骨细胞、神经星状细胞分化的功能相继丧失，但是体外培养的间充质干细胞 向成骨细胞的分化能力可维持20代以上，有研究证实不同种属间间充质干细胞可能有差异因此今后的研究需要深入了解脂肪干细胞在局部骨缺损修复中的作用，并寻找最佳的局部环境促进其成骨分化。自然状态下，体内调控干细胞成骨分化的环境信号，包括局部微环境内的细胞因子、细胞与细胞或细胞与基质的相互作用，以及机械应力等，在今后，对这些因素的更多发现，及其对它们相互作用的更深入理解可能是体外条件下精确地
14、调控脂肪干细胞成骨分化的关键。目前，已有应用自体脂肪干细胞修复大面积颅颌面缺损的报道，随着对脂肪干细胞成骨机制的了解，相信脂肪干细胞参与构建的组织工程化骨将会尽快地真正应用于临床大面积骨缺损的修复。 针对性别因素对脂肪干细胞分化影响的研究发现,雌性动物的脂肪干细胞脂肪分化趋势较强,而雄性动物的脂肪干细胞更易表达成骨标志物,这可能与激素促进了脂肪干细胞 向脂肪细胞分化有关。 与此相应,科学家研究发现,男性脂肪干细胞的成骨分化时间早于女性,分化速度更快,分化效率也明显高于女性。 目前,对胚胎期及出生后骨发生分子机制的研究受到广泛关注,一些分化调控因子,如骨形态发生蛋白骨髓的间充质干细胞家族等,被用
15、来增强脂肪干细胞体内、外的成骨分化能力。骨髓的间充质干细胞家族属于旁分泌的转化生长因子TGFB家族。大量研究示,骨损伤愈合过程中, 骨髓的间充质干细胞具有刺激间充质干细胞向成,目细胞分化的作用。骨髓的间充质干细胞通过与细胞表面骨髓的间充质干细胞受体结合,磷酸化下游信号分子RSmad(Smad l、5和8),磷酸化的RSmad与Smad 4结合形成复合体.进而与核内转录因子结合,调控成骨相关靶基因I型胶原蛋白、OPN 和OCN 等的转录.目前通过转染骨髓的间充质干细胞基因至脂肪干细胞,证实内源性表达增强的骨髓的间充质干细胞2、骨髓的间充质干细胞4和骨髓的间充质干细胞7等能明显增强脂肪干细胞的体内
16、、外成骨能力。 脂肪干细胞上皮分化在喉组织工程中的应用. 声带瘢痕是一个较难解决的临床问题，尚缺乏有效的治疗手段，目前其主要的治疗方法是向声带中注射填充物或细胞，试图恢复声带浅层的振动性。声带振动受损主要是由于固有层细胞外基质的中断、胶原沉积增多、弹性纤维的丢失等引起。有证据表明声带注射细胞或基质对恢复声带黏膜波的作用是有的。另外，从人的声带中获取成纤维细胞比较困难。现有的组织工程方法是将声带的成纤维细胞包被在一系列的支架上。用自体细胞来源的组织结构工程代替声带被覆黏膜可能成为严重声带瘢痕的治疗方式。 实现该目标的第一步是构建类似于声带固有层和上皮层的三维细胞群基质。切除声带瘢痕后，用新的有组织结构的细胞外基质和上皮作为替代物，改善声带的振动功能。本研究便是介绍一种新的组织工程方法来构建声
