电化学发光原理及优势

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1、电化学发光 原理及优势 Ajry ZhouAjry Zhou 电化学发光原理 电化学发光免疫测定-ECLIA Electro chemi luminescence immuno assay 是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。 它的 标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同，是一种在 电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括 了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是 电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。 ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA RNA探针检测。 是继放射免疫(RIA)、酶免疫(EIA)、荧光免疫(FI

2、A)、化 学发光免疫(CLIA)测定以后的新一代标记免疫测定技术。 电化学发光技术电化学发光技术 ElectroChemiLuminescence (ECL) 结合 标记抗体 结合磁 性微珠 转移至 电极 施加电压 启动反应 信号检测 ECL 是罗氏在免疫检测方面的专利技术。 ECL 技术配以精心设计的免疫试剂，使得 罗氏能够给出精确而敏感的检测结果。 ECL 反应的过程: 标记Ruthenium的高特异性抗体与被测物结合后 与顺磁性微珠结合 利用磁场吸附磁性微珠;用ProCell溶液将结合了 磁性微珠的抗原抗体复合物与未结合的组分分 离。 施加电压启动反应 用光电倍增管检测发射光信号 发射光

3、信号与被测物浓度成线性关系 电化学发光底物电化学发光底物- - 三联吡啶钌三联吡啶钌N羟基琥珀酰胺羟基琥珀酰胺(NHS)酯酯 抗原抗体结合抗原抗体结合 免疫复合物的形成 Source: Roche Diagnostics Research and Development 抗体 Ruthenium 生物素 抗体 抗原 免疫复合物 第一抗体标记生物 素（与微磁珠结合） 第二抗体标记 Ruthenium（产生光 信号） 两种抗体皆能与靶 抗原特异性结合 夹心法反应 竞争法反应 生物素链霉亲和素特异性亲和生物素链霉亲和素特异性亲和 作用作用 磁性微珠 生物素与链霉素特异 性亲和作用 反应体系中待测抗原

4、 可最大限度地与微磁 珠结合 提高检测反应的灵敏 度 形成的免疫复合物转移至测量池 开始ECL反应 ECL反应过程如下: 反应溶液被转移至测量池。加上磁场的测量池表面吸附磁性微珠。 加入ProCell洗脱溶液中未结合的组分并提供ECL反应所必须的TPA 。 施加电压启动ECL反应。电化学反应过程：在工作电极上(阳极)加一定的 电压能量作用下，二价的三联吡啶钌 Ru(bpy)32+ 释放电子发生氧化反 应而成为三价的三联吡啶钌 Ru(bpy)33+，同时，电极表面的TPA也释放 电子发生氧化反应而成为阳离子激发态 TPA+ ，并迅速自发脱去一个质 子而形成激发态三丙胺，这样，在反应体系中就存在具

5、有强氧化性的三 价的三联吡啶钌 Ru(bpy)33+ 和具有强还原性的激发态三丙胺。 化学发光过程：具有强氧化性的三价的三联吡啶钌 Ru(bpy)33+ 和 具有强还原性的激发态三丙胺发生氧化还原反应，结果使三价的三联吡 啶钌 Ru(bpy)33+ 还原成激发态的二价的三联吡啶钌 Ru(bpy)32+，其能 量来源于三价的三联吡啶钌 Ru(bpy)33+ 与激发态三丙胺之间的电势差， 激发态 Ru(bpy)32+ 以荧光机制衰变并以释放出一个波长为 62Onm 光子 的方式释放能量，而成为基态的 Ru(bpy)32+。 循环过程：上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三联吡 啶钌 Ru(b

6、py)32+ 和三丙胺(TPA)，使得电极表面的电化学反应和化学发 光过程可以继续进行，这样，整个反应过程可以循环进行。 通过上述的循环过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大 大提高，所以 ECL 测定具有高灵敏的特点。. 由光电倍增管检测发射光信号 测量池 抗原/抗体 生物素 亲和素包被的磁性微粒子 ProCell M solution (TPA 三丙胺) CleanCell M solution (KOH- 清洗液) 电压 铂金电极 磁铁 光电倍增管 最重要的组成部分 信号的检测信号的检测 光电倍增管检测信号 丰富的免疫检测项目丰富的免疫检测项目 超过85项检测项目 0 20 40

7、60 80 VITROS ECiQVISTA LOCIIMMULITECentaurARCHITECT Access IIcobas e analyzers 由于由于 ECL 技术能适合多种免疫反应原理，其特有技术能适合多种免疫反应原理，其特有 的优势使得罗氏能够开发出大量的检测试剂。的优势使得罗氏能够开发出大量的检测试剂。 试剂稳定试剂稳定 开瓶有效期长 0102030405060 VITROS ECiQ IMMULITE Vista LOCI Centaur ARCHITECT Access II cobas e analyzers 开瓶有效期（天） 可控的反应体系 高精密度和 高灵敏度

8、低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技为什么选择电化学发光技 术术 ECL优势 ECL技术采用磁场分离待测组分，使用电 压而不是化学品来控制化学发光反应。 高精密度和 高灵敏度 低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技术为什么选择电化学发光技术 ECL优势之一 可控的反应体系 可控的反应体系可控的反应体系 采用磁场分离待测物 施加磁场，吸附磁 性微珠 加入ProCell溶液分 离绑定磁珠的免疫 复合物 去除影响信号检测 的因素显著提高检 测结果灵敏度 将没有磁珠绑定的组分分离出反应系统后光电倍 增管才能准确检测发射光信号，否则，游离

9、的 其他组分会影响信号的检测。因此，这一过程 对反应的控制和信号的检测是很必要的。 可控的反应体系可控的反应体系 施加电压启动电化学发光 反应 电压的应用是电压的应用是ECLECL反应可控性反应可控性 的关键：的关键： 三联吡啶钌和三丙胺正常状 态下非常稳定，只有电压存在 的情况下才会被激活 ECL技术的特点:施加电压启 动电化学发光反应 0 15 30 45 60 2.0 0 .4 .8 1.2 1.6 75 ECL 电压 ECL信号强度 (000 counts) 电压(V) 0.5 0 1.0 1.5 时间(秒) 电压作为反应的启动开关能有效的消除由于试剂添加或混匀所带 来的问题从而保证反

10、应稳定而可控的进行 可控的反应体系可控的反应体系 信号产生迅速 可控的反应可控的反应 信号产生均一而稳定 化学发光技术化学发光技术 反应启动不均一 电化学发光技术电化学发光技术 电压启动反应 信号均一稳定 高精密度和 高灵敏度 可控的反应体系 低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技为什么选择电化学发光技 术术 ECL优势之二 高精密度和高灵敏度高精密度和高灵敏度 生物素链霉亲和素特异性亲和作用 生物素作为第二标记物与包被链 霉亲和素的微磁珠结合 生物素与链霉亲和素特异间的特 异性亲和作用是目前已知的最牢固 的非共价生物结合作用 最大限度的捕获待测免疫复合物 大大

11、提高ECL反应的灵敏度 高精密度和高灵敏度高精密度和高灵敏度 信号循环放大并保持稳定 循环放大的过程是指 信号能不断生成且保 持稳定 光电倍增管准确检测 信号 ECL反应中Ru(bpy)33+ 与Ru(bpy)32+之间的转化 循环发生，因此产生的信号不断增强并保持稳定，这 一过程我们称之为信号的循环放大。 高精密度和高灵敏度高精密度和高灵敏度 信号迅速生成且保持稳定 0 15 30 45 60 75 ECL 信号强度 (000 counts) 0.5 0 1.0 1.5 时间 (秒) Flash CL ECL 高精密度和高灵敏度高精密度和高灵敏度 信号迅速生成且保持稳定 0 15 30 45

12、 60 75 ECL信号强度 (000 counts) 15 0 30 45 时间(分钟) Glow CL ECL 可控的反应体系 高精密度和 高灵敏度 低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技术为什么选择电化学发光技术 ECL优势之三 ECL技术因其灵敏度很高，所以标本检测用量很低。 低标本检测用量低标本检测用量 与市场上主要产品的比较 050100150200 VITROS ECiQ Immulite Vista LOCI Centaur Access II Architect cobas e analyzers 标本检测用量 (ul) Max. Ave. M

13、in. 低标本检测用量低标本检测用量 患者的痛苦更小 ARCHITECT cobas e systems 0 200l 600l NT-proBNP / BNP Troponin T/I CK-MB Myoglobin 400l Vista LOCI 可控的反应体系 高精密度和 高灵敏度 低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技为什么选择电化学发光技 术术 ECL优势之四 稀释复检 宽广的检测范围宽广的检测范围 更少的复检 -14 -12 -10 -8 -4 log (Ru(bpy)32+)/M) 8 6 4 2 0 -6 Log (ECL intensity (

14、counts) 宽广的检测范围宽广的检测范围 与市场上主要产品的比较 0%25%50%75%100% VITROS ECiQ IMMULITE Vista LOCI Centaur Access II ARCHITECT cobas e systems 以cobas e system试剂检测范围为基准的百分比 anti-TPO CA 125 Estradiol HCG+b Progesterone PTH 可控的反应体系 高精密度和 高灵敏度 低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技为什么选择电化学发光技 术术 ECL优势之五 快速的检测时间快速的检测时间 与市场

15、上主要产品的比较 010203040506070 VITROS ECiQ Vista LOCI Immulite Centaur ARCHITECT Access II cobas e analyzers 标本检测时间(分钟) Max Average STAT 快速的检测时间快速的检测时间 最迅速的急诊项目检测时间 051015202530354045 VITROS ECiQ Vista LOCI Immulite Centaur ARCHITECT Access II cobas e analyzers 标本检测时间(分钟) PTH NT-proBNP / BNP Myoglobin CK-MB Troponin hCG 可控的反应体系 高精密度和 高灵敏度 低标本检测用量 宽广的检测范围 快速的检测时间 为什么选择电化学发光技为什么选择电化学发光技 术术 ECL优势 参考网站参考网站 http:/ http:/ http:/ http:/ 讲稿中所引用的数据等信息均来自于以上网站（2009.7） 谢谢您的关注谢谢您的关注 Roche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031 Ch