invitrogen trizol中文说明书

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1、TRIZOL Reagent Cat. No. 15596-026 Size: 100 ml Store at 2 to 8C. 警告：在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤警告：在与皮肤接触及吞咽有毒。可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤 剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应就医（如需要，应出示本产品标签）。剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应就医（如需要，应出示本产品标签）。 本产品含有苯酚（本产品含有苯酚（108-95-2）和其他成分（）和其他成分（NJTSRN 80100437-5000P）。）。 已经证明 TRIZOL 在室温下可稳定保存 12 个月。不过，我们

2、建议在储存于 2-8C，以保证 最佳性能。 描述： TRIzol 试剂（美国专利号，5346994）是即用型细胞和组织总 RNA 提取试剂。该试剂 是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案， 是对 Chomczynski 和 Sacchi 开发的单步 RNA 提取法 （1）的改善。在匀质化或溶解样品中，TRIzol 试剂可保持 RNA 的完整性，同时能破坏细 胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。 RNA 存在于水相。水 相转移后，RNA 通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，样品中 DNA 和蛋白质可通过相继沉淀 回收 （2） 。 用乙醇沉淀可从中间相得到 DNA， 加入异丙醇沉淀可

3、从有机相得到蛋白质 （2） 。 与 DNA 的共纯化可能对不同样品得到的 RNA 的归一化有用。 此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织（50-100 毫克）和细胞 （5106），以及大量的组织（1 g）和细胞（107）。该 TRIzol 试剂方法简单，允许大量 样本同时处理。 整个过程可在一小时内完成。 用 TRIZOL 提取总 RNA 可避免蛋白质和 DNA 污染。可用于 Northern blot 分析、斑点杂交、poly（A）+选择、体外翻译、RNA 酶保护分 析和分子克隆。聚合酶链反应（PCR 反应）中，当两条引物位于单个外显子时，推荐使用 扩增级 DNA 酶 I(C

4、at. No. 18068)处理分离出的 RNA。 TRIzol 试剂方便提取不同种类、不同分子大小的 RNA。例如，从大鼠肝中提取 RNA， 经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，高分子量 RNA 离散带其长度可高达 7 kb 和 15 kb，(组 成 mRNAs 和 hnRNAs)，两个主要的核糖体 RNA 带在5 kB（28 S）和2 Kb（18 S） 。低分 子量 RNA 介于 0.1 和 0.3 kB 之间（tRNA，5S） 。分离出的 RNA 用 TE 稀释，其 A260/A280 比值1.8。 防止 RNA 酶污染的注意事项 通过不当的技术操作， RNA 酶可在任何提取程序中意外引入

5、RNA 的制备中。 由于酶的 活性难以抑制，所以必须防止其引入。进行 RNA 工作时，下列准则应予以遵守。 总是戴着手套。 皮肤上通常包含的细菌和霉菌， 可污染 RNA 的制备， 同时也是 RNA 酶的一个来源。良好的微生物操作技术可防止微生物污染。 使用无菌制品， 专为 RNA 工作准备的一次性塑料器皿和自动吸管可以避免与共用设 备的 RNA 酶交叉污染。例如，一个实验室正在使用的 RNA 探针可能用得上 RNA 酶 A 或 RNA 酶 T1 以减少过滤背景，其中任何非一次性物品（如自动吸管）可能是大量 RNA 酶的 来源。 TRIzol 试剂的存在，可保护 RNA 酶对 RNA 的污染。下

6、游样品处理要求非一次性的 玻璃器皿或塑料器皿无 RNA 酶。玻璃物品可以在 150 C 烘烤 4 小时，塑料制品，可浸泡 10 分钟的 0.5 M NaOH 溶液，然后用清水彻底冲洗，并高压蒸汽灭菌。 其他需要注意的事项： 用小于 2 毫升体积的 TRIZOL 试剂工作时，建议使用一次性透明聚丙烯管。 对于较大的体积，用玻璃（Corex）或聚丙烯管，并测试以确保该管装满 TRIzol 试剂和 氯仿时可承受 12,000g 的离心力，不要使用泄漏或有裂纹的管子。 离心前小心平衡管子的重量 玻璃管必须用封口膜密封，密封时封口膜要覆盖有螺丝处，聚丙烯管离心前必须盖好。 RNA 提取的指导提取的指导：

7、 警告：当使用 TRIzol 试剂工作时，应使用手套，并保护眼睛（屏蔽、安全护目镜） 。避免与 皮肤或衣服接触。使用化学通风橱。避免吸入蒸气。 除非特别注明，所有程序均在15 -30C下进行，试剂也放置于15 -30C。 需要的试剂为： 氯仿 异丙醇 75% 酒精(溶于 DEPC 处理的水中) 无 RNase 的水或 0.5% SDS 溶液 RNase-free 水的准备：把水加入到 RNase-free 的玻璃 瓶中，加入 diethylpyrocarbonate (DEPC)至 0.01% (v/v). 静置过夜，高压蒸汽灭菌。SDS 溶 液必须使用 DEPC 处理的水，并高压灭菌。 1.

8、 均质化 (see notes 1-3) a. 组织 均质 50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的 TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃或强力均质机 （Polytron, or Tekmars TISSUMIZER TISSUMIZER 或相当的仪器）。均质时样本体积不 应超过 TRIzol 试剂体积的 10。 b. 单层细胞 直接在培养皿中裂解细胞，3.5 厘米直径的皿中加入 TRIzol 试剂 1 毫升，并通过抽吸几次 促进细胞裂解。TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每 10 平方厘米加 入 1 毫升） 。TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的 RNA 有 D

9、NA 的污染。 c. 悬浮细胞 离心沉淀细胞。在 TRIzol 试剂中重复吹打以裂解细胞。1 毫升试剂用于 5-10106的动物、 植物或酵母细胞，或 1107细菌细胞。使用 TRIzol 试剂前应避免洗涤细胞，因为这增加了 mRNA 降解的可能性。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。 可选: 一些样品可能需要额外的分离步骤，这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量 高，如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。同质化之后，2-8C、12000 g 离心 10 分钟， 移除不溶物。 由此产生的沉淀含有细胞外膜结构、 多糖、 分子量高的DNA， 而上清含有RNA。 从脂肪组织等脂肪过多的样本

10、收集的上层脂肪应弃去。 在每种情况下， 均应转移净化后的均 质溶液到新管，加入氯仿进行下述相分离。 2. 相分离 15-30 C 孵育 5 分钟，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。每 1 毫升的 TRIzol 试剂添加 0.2 毫升氯仿。小心盖好样品管。用手大力摇管 15 秒，15-30C 孵育 2-3 分钟。2-8C，不超 过 12,000 g 离心 15 分钟。离心后，混合物分离为红色下层（酚-氯仿相） 、中间相以及上层 的无色水相。 RNA 存在于水相。水相体积约为 60均质时使用的 TRIzol 试剂量。 3. RNA 沉淀 水相转移到一个新管，并保存有机相（如希望分离 DNA 或蛋白

11、质）。混合异丙醇以从水相 中沉淀 RNA。 每 1 毫升用于初始的同质化的 TRIzol 试剂使用 0.5 毫升异丙醇。 15 到 30孵 育样品 10 分钟，2-8C，不超过 12,000 g 离心 10 分钟。往往离心前 RNA 沉淀不可见，离 心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。 4. RNA 洗涤 弃上清。用 75的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。每毫升用于初始同质化的 TRIzol 试剂使用至 少 1 毫升 75的乙醇。涡旋混合。2-8C，不超过 7,500g 离心 5 分钟。 5. 重新溶解 RNA 在该过程结束时，简单干燥 RNA 沉淀（空气干燥或真空干燥 5-10 分钟） 。不要

12、真空离心干 燥 RNA。 重要的是不要让 RNA 沉淀完全干燥， 因为这将大大降低其溶解度。 部分溶解 RNA 样品， 其 A260/280 比值 200 g DNA 或或大量非大量非 DNA 物质的大沉淀，需要物质的大沉淀，需要 0.1M 柠柠 檬酸钠檬酸钠-10乙醇溶液乙醇溶液额外的洗涤额外的洗涤。 3. 重溶 DNA 打开离心管口，空气干燥 DNA 5-15 分钟。（不要离心干燥，因为溶解更难。）用 8 mM 氢 氧化钠溶解 DNA，至 DNA 浓度为 0.2 0.3 g/l。通常添加 300 600 l of 8 mM NaOH to DNA isolated from 107 cel

13、ls or 50 70 mg of tissue. 强烈推荐强烈推荐在弱碱中重悬，因为分离的 DNA 在水中或 Tri 缓冲液中不能重悬。8 mM NaOH 的 pH 值只有9，一旦 DNA 溶解于其 中，可以很容易的用 TE 或 HEPES 进行调节。在此期间，DNA（尤其是来自组织的 DNA） 中可能含有不溶性胶状物（膜碎片等等），12,000 g 离心 10 分钟去除不溶物。将含 DNA 的上清转移到一个新管。在 8 mM NaOH 中溶解的 DNA 可储于 4 C 过夜。如长期贮存，样 品液应使用 HEPES 调整 pH 值至 7-8（见表）并添加 1 mM EDTA。一旦 pH 值调

14、整后， DNA 就可以储存在 4 C 或-20 C。 溶于溶于 8 mM NaOH 的的 DNA 可在可在 4保存数月，保存数月， -20保存一年，保存一年， -70 未测定。未测定。 DNA 定量与产量预测： 在 8 mM NaOH 中溶解的 DNA，取出一部分与水混合，并测量其 A260 的值。用 A260 的值 计算双链 DNA 含量。1 A260 单位=50 g 双链 DNA /mL。按照样本细胞数计算，每 1106 人、大鼠或小鼠二倍体细胞可分别产生：7.1g，6.5g 和 5.8g 的 DNA（3）。每 mg 肝和 肾组织产生 3-4 ug DNA，每 mg 骨骼肌、脑和胎盘可产生

15、 2-3 ug DNA；每 106人、大鼠和小 鼠来源的培养细胞可产生 5-7 ug DNA。 应用 PCR扩增DNA ： 在 8 mM NaOH 中溶解 DNA 后，用 HEPES 调整 pH 值为 8.4（见表）。添加 0.1-1.0 g DNA 样本至 PCR 反应混合物，执行标准 PCR 程序。 限制酶反应： 用 HEPES 调整 DNA 溶液的 pH 至希望的值 （见表） 。 样本也可用 1 mM EDTA， pH 7-pH 8.0 进行透析。每 g DNA 使用 3-5 个 units 的酶。对特殊的酶，使用酶制造商建议的条件，并 让反应持续 3-24 小时。在一般实验中，80-9

16、0的 DNA 可被消化。 溶解于8 mM NaOH的DNA样品的pH调整： (1 ml 8 mM NaOH 使用以下量的 0.1 M 或 1 M HEPES 调整，不用酸) DNA Isolation Notes: 1. 苯酚相和中间相可在 2-8C 保存过夜。 2. 溶解于 75%乙醇的样品可在 2- 8C 下保存数月。 3. 溶解于 8 mM NaOH 的样品可在 2-8C 下保存过夜。为长期保存，应调整其 pH to 7-8， 并调整 EDTA 浓度至 1 mM。 蛋白质分离指导：蛋白质分离指导： 用乙醇沉淀 DNA（步骤 1，DNA 沉淀）后，蛋白质可从苯酚-乙醇上清中获得。由此产生的 蛋白质可用于 Western blotting 分析（2）。 需要的试剂： 异丙醇 0.3 M 盐酸胍（溶于 95%乙醇）