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1、1 Biacore 检测检测 Fcn 效应分子和效应分子和 IgG 相相 互作用的操作方法互作用的操作方法 2 目录目录 一、实验目的：. 3 二、实验试剂和耗材 . 3 三、 实验步骤 4 （一）、仪器准备 . 4 （二）、样品稀释 . 8 （三）、样品检测过程 . 8 （四）、实验结果分析 . 22 3 BiacoreT200 检测检测 Fcn 效应分子效应分子与与 IgG 结合结合操作指南操作指南 一、实验目的：一、实验目的： 利用 Biacore 检测 Fcn 效应分子与 IgG 结合的动力学数据 Ka、Kd及亲和力 数据 KD。抗原 Fcn 分子量为 43.5KD，商业化蛋白带有 H
2、is 标签；IgG 分子量 为 150KD。本实验利用 NTA 芯片捕获 Fcn，IgG 分子作为分析物检测 Fcn 与 IgG 结合的动力学数据和亲和力数据。 二、实验二、实验使用机型、使用机型、试剂和耗材试剂和耗材 1、本实验所用的机型为：Biacore T200 。 2、S 系列 NTA 芯片及试剂盒（试剂盒内含有 0.5mM Nicl2 溶液和 350mM EDTA）。S 系列 NTA 芯片货号：BR-1004-07（一片装），BR-1000-34（三片 装）；NTA 试剂盒货号：28-9950-43 。购买地均为 GE Healthcare。 3、缓冲液：10 pBS-P+ pH 7
3、.4（货号：28-9950-84）；购买地为 GE Healthcare。 4、去离子水（用 0.22uM 膜过滤过）。 5、配体 Fcn：如果为商业化蛋白粉末，用水稀释到 100ug/ml 或 200ug/ml， 分装在-20保存。推荐使用：Sinobio，无论使用哪家的 Fcn，客户需要确 定 Fcn 的活性，在进行溶解时，确保溶解液中不含 Tris。 6、IgG：母液 IgG 浓度至少在 1.5mg/ml，样品体积在 200ul 以上纯度90% 以上（即跑 SDS-PAGE 胶有两条带）。如果 IgG 中的盐离子浓度或多糖浓度 过高可进行脱盐，如果体积小于 500ul 选择 GE Hea
4、lthcare 的 PD MiniTrapTM G-25，货号 为 28918007；如果体积小于 1ml 选择货号为 28918008 的 GE Healthcare 的 PD MiniTrapTM G-25；如果体积在 1.75-2.5mL 选择 GE Healthcare 的 PD-10 Deasalting，货号为 17085101。 4 6、其他耗材：无盖 1.5 ml EP 管（货号：BR-1002-87）、96 孔板（货号： BR-1005-03）、2 型橡胶盖（货号：BR-1004-11）、96 孔板封口膜（货号： 28-9758-16），购买地均为 GE Healthcare
5、。 三、三、 实验步骤实验步骤 （一（一）、）、仪器准备仪器准备 1、开机操作 1) 打开Biacore T200系统和电脑的电源开关。Biacore T200的电源开关位于系 统背面的左下角。开机后，需等待检测单元的温度达到预设温度（用户自设， 通常为25）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁， 该过程可能需要30-60分钟。 2) 打开Biacore T200 控制软件（StrartProgramBiacoreBiacore T200 Control Software），运行后软件程序会自动和主机系统建立连接。 3) 准备运行缓冲液。已经0.22m膜过滤）：量取50ml 1
6、0XHBS-EP+缓冲液、 450ml去离子水，混匀后放入500ml缓冲液瓶。 2、 缓冲液的放置 1) 将已经配制好的缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单 孔盖。 2) 将缓冲液进液管A（注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余 三根进液管（B、C和D）放在左侧的舱门后。 3) 将2L的废液瓶放置在T200系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。 4) 取500ml去离子水装入500ml缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上，并将进 液管A插至瓶底。瓶中的水将用于清洗进样针。 3、 芯片的放置 1) 点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Insert Chip选项，打
7、开芯片舱 门。 2) 如果已经有芯片在芯片舱内，点击工具条中的 按钮或选择Tools菜单中 的Eject Chip选项。 5 点击Eject Chip，流动池中的液体将被排空，随后芯片舱门将自动打开。 3) 如果使用的是新芯片，选择New Chip。在Chip Type的下拉菜单中选择对应 的芯片种类（此实验为NTA芯片），在Chip Id中填入和芯片相关的实验信息， Chip lot No.中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择 Reuse Chip，并在Chip Id下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。 4) 手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入
8、卡 槽，最后合上芯片舱的舱门。 芯片的放置方法 5) 点击Dock Chip按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。 6) 选择ToolsPrime命令，点击Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部 的流路系统，整个过程耗时6-7分钟。结束后，点击Close，系统自动转入待 6 机（Standby）状态。注意：当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行Prime 程序。Prime时缓冲液会冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备。 4、放置试管架 1) Biacore T200有三种不同的试管架供用户使用：Reagent Rack 1、Reageng Rack 2（图A）和Sa
9、mple and Reagent Rack1（图B），见下图。 图A：Reagent Rack 1 在 Sample 一栏中 Contact time 为 120s，Flow rate 为 30ul/min， Dissociation time 为 240s; 在 Regeneration 一栏中，Solution 为 350mMEDTA，Contact time 为 60s， Flow rate 为 30ul/min，接着点 Next。修改后的界面如下： 16 8、在 Kinetics/Affinity-Sample 界面中，填写分析物信息：Sample id 填写样品 名称，MW(Da)填
10、写分子量，第一个 Concentration 为摩尔浓度将其调为 uM， 第二个为质量浓度，摩尔浓度填完后质量浓度会自动计算。接着点 Next。以 IgG a、b 为例进行填写如下： 17 注意：此实验要将摩尔浓度单位调为 uM，每个样品的 0 浓度和低浓度进行 一次进样重复，样品浓度由低到高填写。 9、在 Kinetics/Affinity-System Preparations 界面下，直接点 Next 进入 Rack Position 界面： 18 10、在 Kinetics/Affinity-Rack Position 中： 将 Reagent Rack 改为 Reagent Rack
11、1； 19 点开 Menu 后选 Automatic Positioning； 20 进入下面界面后，将 Pooling 一栏全部改为 Yes，Vial Size 根据需求进行调整。 21 10、根据需求可将样品所在位置进行调整，鼠标长按样品所在位置托拽到所 需要的位置。 22 11、点 Next 后，对方法进行保存，在对数据路径进行保存，便会运行。 （四四）、实验结果分析、实验结果分析 1、打开数据分析软件 Biacore T200 Evaluation Software 3.0（或 2.0），点 file 中的 open 找到文件。 2、在打开界面的左边 Plot 一栏中，Capture
12、的值应该在 40Ru 左右， Capture2 应该在 200Ru 左右。接着点 Kinetics/Affinity，在下拉栏里点开 Surface bond。 23 3、在 Kinetics/Affinity-Select Curves 界面的 Select evaluation mode 下面选择 Single mode；在 Curve 一栏中 Sample 的下拉栏中可以选择待分析的样品；如 果哪个浓度的样品检测的结果不合适，可以在样品浓度表格中将此浓度前的 对号勾掉，以删除次浓度。接着点 Next。 24 4、在接下来的界面中点 Kinetics。 5、到 Kinetics/Affin
13、ity-Fit Kinetics 界面，Model 模式选择为：1：1Binding， 接着点击 Fit 进行数据的拟合。拟合结束后，显示如下界面： 25 在数据显示栏里， Quility Control 都亮绿灯表示检测数据好，如果亮黄灯数 据还能接受，但如果亮红灯说明数据检测超过机器检测限，需要调整实验。 数据显示栏里的 Report 中显示各个数据，包括动力学数据、Chi2值等。 四、实验结果四、实验结果 抗原 Fcn 与 IgG 结合的 KD 值约为 5.510-7 M。数据传感图为： 注意：1、抗原 Fcn 捕获量约为 300Ru，根据抗原 Fcn 蛋白活性和纯度不 同可将捕获时间和捕获浓度进行调整。2、传感图的 Ru 值根据 IgG 不同，值 会不同。3、此次实验结果为 5.510-7 M，最终的实验结果根据样品不同略 有不同，但不应该超过 5 倍。 -20 0 20 40 60 80 100 120 -100-50050100150200250 RU Response Times
