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1、细胞培养技术与应用,卢安尚 中山大学动物中心细胞库 87330450,概述,细胞生物学、分子生物学以及免疫学是现代三大前沿生物科学，发展异常迅速。细胞培养是细胞生物学研究中最常用的方法之一。由于在体外培养中和机体内，细胞行为的基本规律是一样的，因此许多研究可以在体外进行。更重要的是，在培养条件下，人们可以有目的的、有选择地控制细胞生长的环境，因此可以研究在某些特殊条件下的细胞生物学行为。本讲主要目的是介绍动物细胞培养技术及其应用。,组织培养的分类和基本概念,一 分类 1.组织培养(Tissue Culture)指的是从体内取出组织摹拟体内生理环境,在无菌 、适当温度和一定营养条件下,使之生存和
2、生长并维持其结构和功能的方法。 2.细胞培养(Cell Culture):培养物是单个细胞和细胞群。 3.器官培养（Organ Culture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官,使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法.,历史,1885年Roux最早尝试使组织离体培养,材料是鸡胚神经板,采用生理盐水为培养液,并首次采用组织培养这个术语。1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养。,体外培养技术的发展大致可分三个时期：50年代之前是细胞培养在多个领域发展期；50年代是细胞培养迅猛发展期，多种培养技术相继建立；50年代后是
3、体外培养技术与生命科学其他技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术。,由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。,在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的两类不同细胞间的融合细胞后，为细胞融合技术的发展和应用，及杂交瘤技术奠定了基础,并推动了细胞生物学、细胞免疫学、细胞遗传学、病毒学等学科的交叉与发展。随着细胞生物学和分子生物学间的相互渗透交叉，分子克隆技术与细胞培养技术相结合，
4、在阐明基因的结构和功能、基因在细胞生长和分化中的作用，以及细胞癌变机制等方面起了重要作用。如基因的克隆及在细胞中的作用、克隆癌基因与细胞生长分化的关系，以及反义癌基因RNA对细胞转化的抑制作用的方面起了重要作用。,组织培养中感兴趣的研究领域,1)细胞内部的种种活动,如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢; 2)细胞内部的流动,如RNA从细胞核向细胞质方向运转,激素受体复合物的易位等; 3)生态学,如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用; 4)细胞与细胞之间的相互作用,如胚胎诱导、细胞群体的动力学等.,1）理化环境可以调控 2）细胞经过多次传代培养形成细胞系，其特征基本相同，对外界影响因素的
5、反应也较为一致。 3）培养物可直接暴露在预测的试剂中，预测样品用量少，并可直接观测反应。 4）可通过繁殖扩增，提供大量均匀的细胞备用，供比较不同因素或同一因素不同剂量对同一细胞株的作用。 5）可以人工筛选具有一定特征变异的细胞株或细胞融合，有利于基因功能的研究。 6）组织培养结合缩时电影技术，可以直接观察细胞的活动和对外界作用的反应。,细胞培养应用的优点,组织培养的细胞生物学特点,体内外细胞的差异和分化 细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性,增殖使细胞数量增多;分化使机体结构和功能多样化,最后演变成完整的有机体 。,体内外细胞的差异,当人工条件和体内实际情况不完全相同时,细胞在体外
6、培养后,一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响,生活在缺乏动态平衡的环境中,发生变化则是必然.细胞最多见的表现是:返祖（Atavism）现象失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。,培养细胞的分化,不适应（Deadaption）细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性. 脱分化和去分化（Dedifferentiation）由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后,储存肝糖元的能力丧失,并很难再现. 所以说,不适应和脱分化两个概念不同.不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制;从分
7、子水平考虑,脱分化很可能是基因变异所致.,培养细胞的形态,1.贴附型： 1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等 2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等 3）游走型细胞：神经胶质细胞 4）多形型细胞：神经组织细胞 2.悬浮型：如癌细胞和血液白细胞,体外培养细胞类型,组织培养细胞的生长和增殖,1.原代培养（Primary Culture）阶段：原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养 ，随不同的组织时间长短不一，一般为1-4w。 2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞
8、系（Cell line）阶段。细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。 二倍体细胞系（Diploid cell line）：即细胞保持二倍体核型。 3.衰退阶段： 细胞增殖减慢或不增殖，甚至最后凋亡。但少数情况下，在这三期的任何一点，由于某种因素影响，细胞发生自发性转化。（物理 化学 病毒等因素,自发性转化（Spontaneous Transformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）:即细胞获持久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)，如：
9、HeLa(人宫颈癌细胞系),SV-3T3(SV40转化小鼠3T3细胞,BHK(仓鼠肾成纤维细胞),F9(小鼠胚胎癌细胞),M2R(黑色素瘤细胞)等.,正常细胞培养生命周期,组织培养细胞的传代培养,当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。所谓细胞“一代”即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。,一代周期内细胞生长的三个时期,1）潜伏期（Latent phase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。2倍体细胞该期时间长（24-96h），连续细胞系时间短（10-30min）。,2) 指数生长
10、期（Logarthmic growth phase）：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index MI）表示：即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制（Contact inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。但癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Dens
11、ity inhibition）。,3）停滞期（Stagnate phase）：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少,代谢产物积累,PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。,生长曲线图,细胞的传代方法,贴壁型细胞的传代： 清洗消化终止消化离心重悬加入新的培养基 注意：消化时间、无菌操作 悬浮型细胞的传代： 离心重悬加入新培养基,细胞培养的基本条件,1）仪器和设备: CO2孵箱、培养瓶、超净台、纯水设备、干燥除菌设备、低温冰箱等。 2）培养液 ：RPMI1640、MEN、DMEM、等，可根据
12、根据培养需求合理选择。,3）血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清),人血清和其它动物血清.血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。由于不同的研究目的,血清成分往往干扰研究实验,如进行药物和受体及营养等方面的研究时,需要使用无血清培养基. 注意血清批次的影响,4）其它添加成分:缓冲系统常用为HEPES ， HEPES不是起维持pH恒定的作用,而是起恒定和抵抗快速pH变化的,所以调整pH常常用NaHCO3溶液;有机补充物如丙酮酸钠, 谷胺酰氨等;促细胞分裂因子如生长因子类如FGF(成纤维细胞生长因子),EGF(表皮生长因子
13、);贴壁和铺展因子如胶原蛋白,纤粘蛋白等.,5）平衡盐溶液：主要用于稀释和灌注的液体，维持细胞滲透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。 6）抗生素:常用为青霉素(每毫升培养液50-100单位)和链霉素(每毫升培养液50-100微克)，两性霉素（每毫升培养液20-25微克）。,PH：大多数细胞在PH 7.4时生长最好，一般不低于6.8 ,不高于7.6。酚红是常用的指示剂用来检测PH的变化。红色PH7.4；橙色PH7.0；黄色 PH6.5；红蓝色PH7.6；紫色PH7.8。 温度：温度除直接影响细胞生长外，与培养液的PH值有关，温度低
14、时CO2溶解性增加，从而影响PH。 渗透压：细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。,培养液的物理性质,细胞培养的基本方法,一.组织、细胞的解离方法: 1 解离组织: 无菌条件下采取动物组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液中，然后尽快在超净台内进行解离处理。 注意：1）尽量去除脂肪 坏死组织； 2）剪碎组织时，避免损伤组织块； 3）解离组织用的各种酶系，要先低速离心。,2 解离细胞,2 解离细胞:当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物;从单个细胞出发获得细胞群体;从一定量的组织中获得最多的细胞量时,常用酶和鳌合剂进行解离. 1）胰蛋白酶接离细胞法,2）胶原酶解离细胞法:
15、,这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的.胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织.胶原酶最终浓度200u/ml,36.5温育,一般温育4-48h.,3）机械解离细胞法 ：物理手段,1）外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。 2）单层细胞培养：一般1-3天换液一次，细胞长成单层后进行传代。 3）悬浮细胞培养：使细胞呈悬浮状态在培养液中连续生长，这或者是由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞；另一种情况是通过机械搅拌使细胞保持悬浮状态，也可通过选择得到悬浮生长的细胞进行悬浮培
16、养。,3原代细胞培养的方法,血细胞计数的使用,板中四个角上的大格的体积是0.1mm3 细胞个数/ml=4大个细胞总数/4 104 稀释倍数,细胞培养中应注意的几个问题,1）培养液和培养物:一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长,不能盲目增加每单位体积的细胞浓度. 2）PH:7.2-7.4 7.6或6.0 细胞损伤、退变或死亡 3）培养瓶内的空间:一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10. 4）容积、深度、表面面积:培养液体积与表面面积的比例为0.2-0.5ml/cm. 5）去除死细胞: 6) 温度控制：动物细胞培养对温度波动较为敏感。温度低于36.5C，细胞生长缓慢，高于38C，细胞失去活力。,细胞系的培育,原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂,因此在培养初期,存活和生长的细胞类型也是多种多样的.所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长,而且是培养物逐步演进为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞,即细胞系(Cell line).,培育细胞系主要方法,细胞克隆技术:一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁
