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1、实验二、粪便中球虫卵囊的计数、分离和孢子化培养技术（Counting, isolation and sporulation technology for coccidial oocysts in feces）【目的要求】 认识动物常见重要球虫卵囊的形态特征；掌握粪便中球虫卵囊的计数、分离和孢子化培养基本操作方法。这些操作是实验室开展球虫研究最常用的实验技术。【基本原理】 卵囊通常存在于宿主粪便中，从粪便中分离球虫卵囊的方法有饱和食盐溶液漂浮法、饱和蔗糖溶液漂浮法和饱和硫酸镁溶液漂浮法，其中最常用的方法为饱和食盐溶液漂浮法。其原理是悬浮溶液如饱和食盐溶液密度高于卵囊密度，而低于粪便中大多数杂质，
2、经离心或静置沉淀后，大部分杂质沉淀在容器底部，卵囊漂浮在悬浮溶液的表面，然后收集表层漂浮物；由于卵囊比重大于水的比重，所以表层漂浮物用自来水稀释离心后，卵囊沉淀富集于离心管底部即可得到大量球虫卵囊。计算球虫感染强度即每克粪便中卵囊数量（oocysts per gram, OPG）和保存卵囊悬液中卵囊数量通常用麦克马斯特法(McMasters method)和血细胞计数板计数法，应用最广泛的是麦克马斯特法。麦克马斯特计数法的原理是用饱和食盐溶液作为悬浮溶液，把卵囊与比重较大杂质分开，使卵囊漂浮至计数室表层，与计数室上层刻度部分处在同一层面上（或同一视野内） ；计数板上每个计数室容积为 110.1
3、5=0.15mL（如图 1 示） ，镜检计数 0.15 mL 计数室内卵囊数量，最后根据粪便克数和悬液稀释倍数计算 OPG 值或单位体积内卵囊浓度。图 1 麦克马斯特计数板结构示意图在适宜的温度通常 25-28，湿度和充足的氧气条件下，球虫卵囊在体外进行减数分裂，一个卵囊内形成 4 个孢子囊，每个孢子囊内通过有丝分裂产生2 个子孢子。由于粪便中大量的杂质影响氧气扩散，杂菌生长消耗氧气，使卵囊发育不良，因此孢子化培养最好在分离后进行。最好的培养液是 2.5%重铬酸钾溶液，最适宜的培养温度是 28，培养过程中需要搅拌振荡或吹气以达到增氧目的。不同种类球虫卵囊孢子化时间有差异，通常在 4872h。用
4、次氯酸钠处理孢子化卵囊除去污染的细菌和真菌，延长卵囊保存时间。【器材准备】1、试剂材料：新鲜鸡粪便，饱和食盐溶液，2.5%重铬酸钾溶液。饱和食盐溶液的配制：称取 400g 食盐，放入三角烧瓶中，加入 1000 mL 沸水，搅拌充分溶解后，静置冷却，有少量盐析出，即为饱和盐水，比重约为1.18。2.5%重铬酸钾溶液的配制：2.5g 重铬酸钾固体加入 100 mL 蒸馏水，搅拌完全溶解即可。2、仪器用具：低速离心机，托盘天平，显微镜，麦克马斯特计数板，恒温培养箱，空气浴恒温摇床，增氧泵，手动计数器，200mL 锥形瓶，平皿，载玻片，盖玻片，胶头滴管。【实验步骤】1、球虫卵囊的形态学观察认识和了解球
5、虫卵囊包括未孢子化和孢子化卵囊的一般形态结构特征，是进行动物球虫卵囊的计数、收集分离和孢子化培养的前提。球虫未孢子化卵囊：不同种属未孢子化卵囊共同特征是卵囊内呈现一团原生质，包含核质、各种细胞器等结构。其他结构如卵囊形状、大小以及卵囊壁结构与孢子化后相同（如图 2 所示） 。艾美耳属孢子化卵囊：均有 4 个孢子囊，每个孢子囊内包含 2 个子孢子。不同虫种的卵囊形态、大小、有无卵膜孔、极粒、卵囊残体和孢子囊残体等特征存在差异。 （如图 3 所示）等孢属孢子化卵囊：均有 2 个孢子囊，每个孢子囊内包含 4 个子孢子。其他结构特征随虫种而存在差异（如图 4 所示） 。温扬属孢子化卵囊：均有 4 个孢
6、子囊，每个孢子囊内包含 4 个子孢子。其他结构特征随虫种 图 2 球虫未孢子化卵囊结构示意图而存在差异（如图 5 所示） 。泰泽属孢子化卵囊：卵囊内存在 8 个子孢子和卵囊残体，无孢子囊结构（如图 6 所示） 。2、球虫卵囊的计数2.1 粪便中球虫卵囊的计数麦克马斯特法取 2g 新鲜鸡粪便置于干净的 100mL 烧杯内，先加入 8mL 饱和食盐溶液，用玻棒捣碎混匀，再加入 50 mL 饱和食盐溶液，混匀后立即用纱布或 60 目筛网过滤，然后立即吸取滤液充满 2 个计数室，在显微镜载物台上静置 35min，在10 倍物镜下镜检计数，每个计数室内有 100 个方格，其体积为图 5 菲莱氏温扬球虫卵
7、囊1.孢子囊；2.子孢子；3.残体图 3 艾美耳属球虫孢子化卵囊结构示意图1，极帽；2，卵膜孔；3，极粒；4，孢子囊；5，孢子囊残体；6，卵囊残体；7，子孢子图 4 等孢属球虫孢子化卵囊结构示意图1，孢子囊；2，子孢子；3：孢子囊残体图 6毁灭泰泽球虫卵囊1，子孢子；2，残体1cm1cm0.15cm=0.15mL, 分别查完 2 个计数室 100 个方格内的卵囊数量 n1和 n2，最后按照如下公式计算每克粪便中卵囊数量(OPG 值)：OPG= (n1+n2)/(20.15)602其中(n1+n2)/2 为平均每个计数室内卵囊数，0.15 为每个计数室有效体积为 0.15 mL，60 为粪液总体
8、积为 60 mL，2 为所用粪便克数为 2g。2.2 保存卵囊悬液中活性卵囊的计数麦克马斯特改良法（1）每毫升卵囊悬液中卵囊总数量（包括孢子化和未孢子化卵囊）：按照卵囊悬液：饱和氯化钠溶液1：9 的比例混合均匀，迅速从上缘注入计数室内，在显微镜载物台上静置 35min，待卵囊漂浮到上层；然后用 10物镜下观察并计数，每个计数室内有 100 个方格，其体积为 1cm1cm0.15cm=0.15mL,分别查完 2 个计数室 100 个方格内的卵囊数量 n1 和 n2，然后计算每毫升卵囊悬液中卵囊总数量 M，按照如下公式计算： M=(n1+n2)/(20.15)10其中(n1+n2)/2 为平均每个
9、计数室内卵囊数，0.15 为每个计数室有效体积为 0.15 mL，10 为原卵囊悬液稀释 10 倍。如果视野内卵囊数量太多（每个方格内 10-50 个为宜） ，可适当倍比稀释后再按上述方法计数。（2）卵囊孢子化率计算吸取少量卵囊悬液，滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于 40物镜下观察，并计算孢子化卵囊所占的比例 a%。最后计算上述每毫升卵囊悬液中孢子化卵囊数量 N=Ma%。在致病性实验和药物实验中，接种卵囊剂量应该为完全孢子化卵囊的数量。2、球虫卵囊的分离收集取一定量球虫卵囊阳性粪便（根据实验需要称取适量粪便）置于干净烧杯内，先加入少量自来水用玻棒捣碎混匀，再加入 35 倍粪便体积的自来水，混匀后
10、用 6080 目筛网过滤，重复水洗粪便 23 次，最后弃去残渣。对滤液进行 30004000r/min 离心沉淀 6min，弃上清，沉淀用玻棒搅匀加 5 倍体积的饱和氯化钠溶液，30004000r/min 离心漂浮 6min；小心倒出上清于另一干净烧杯内，弃去沉淀。然后用自来水 5 倍稀释上清，30004000r/min 离心沉淀6min，然后弃去上清，重复水洗操作 2 次洗去卵囊沉淀中的盐分。最后沉淀用2.5%重铬酸钾溶液悬浮，镜检分离卵囊情况。3、卵囊孢子化培养与保存将上述步骤 2 中分离收集的卵囊放入 10 倍以上体积的 2.5%重铬酸钾溶液中，于 28摇床内振荡孢子化培养 48h72h
11、，或放入 500mL 玻璃瓶用微型增氧泵吹气孢子化培养 48h72h，或手动吹打振荡孢子化培养 48h72h（手动增氧时液体深度不能高于 7mm） ，培养期间镜检孢子化率达 8090%即可停止培养。为了防止细菌和真菌的污染，长期保存孢子化卵囊，可以将收集的卵囊离心沉淀，向沉淀物中加入 5 倍体积的比重为 1.075 的次氯酸钠溶液，振荡混匀，冰浴处理 10min，然后用 PBS 离心洗涤 2 次。然后再加入 10 倍体积的 2.5%重铬酸钾溶液混匀后，保存于 4冰箱备用。【注意事项】1、采集的粪样一定要新鲜，避免污染，引起误诊。2、饱和食盐溶液一定要饱和，其评价标准是沸水溶解食盐冷却后，有少量
12、晶体盐析出。3、离心前样品要用托盘天平配平，保证离心机转子平衡，避免出现安全问题。4、漂浮离心后，含有卵囊的悬浮液至少用自来水稀释 5 倍以上，方可保证绝大多数卵囊沉淀到离心管底部。5、计算粪便中 OPG 值时，从过滤粪便悬液到镜检计数， 操作要连贯快速，不要间歇，避免卵囊因漂浮造成在粪液中分布不均匀，导致计数不准。另外，粪便滤液注入计数室时要避免气泡产生，在显微镜载物台上要静置 3-5min，保证卵囊上浮至计数室上层。6、计数时，如果视野中卵囊太多（每个小方格 10-50 个卵囊为宜） ，用饱和盐水适当稀释后再计数。每个小方格内卵囊太多或太少，均影响计数的准确度。7、孢子化培养时，局部环境温
13、度不能低于 20高于 30；用搅拌或吹打方式增氧时，重铬酸钾溶液深度不能超过 0.7cm。8、未孢子化的卵囊不能在 4或-20环境下存放，否则会严重影响卵囊的孢子化发育。9、判断卵囊是否完成孢子化的标准是有 80%90%的卵囊完全孢子化，如果孢子化时间过长，过度消耗子孢子能量，反而会影响卵囊活性，缩短孢子化卵囊的保存时间。10、在次氯酸钠灭菌处理过程中会产热，时间过长会影响未孢子化卵囊的孢子化率。因此，被灭菌卵囊应为孢子化卵囊，灭菌过程必须冰浴和定期振荡散热。【实验报告】1、绘制艾美耳属球虫的孢子化卵囊示意图，并标明主要结构特征。2、简述粪便中球虫卵囊马克马斯特计数法的操作过程，并说明操作注意
14、事项。【参考资料】1、鸡、猪、兔、犬和猫球虫常见种类世界公认，鸡球虫共有 7 个种，其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫(E. necratrix)致病性最强；感染猪的有等孢属(Isospora )和艾美耳属球虫多个种，其中猪等孢球虫(I. suis)致病性最强；目前国外认定家兔艾美耳属球虫有 11 个有效种，其中肠艾美耳球虫(E. intestinalis)、黄艾美耳球虫(E. falvescens)和斯氏艾美耳球虫(E. stiedai)强致病种；犬等孢球虫（I. canis）和猫等孢球虫（I. felis） ，形态结构与猪等孢球虫相似，但致病性中度或轻微。
15、图 7 从鸡场粪便中分离的多种艾美耳球虫卵囊多数为未孢子化卵囊，初步判断该鸡场感染 5 种球虫：1 为巨型艾美耳球虫，2 为布氏艾美耳球虫，3 为堆形艾美耳球虫，4 为柔嫩艾美耳球虫，5 为毒害艾美耳球虫。图 10 犬等孢球虫(A)、猫等孢球虫(B)和猪等孢球虫(C)图 8 鸡 7 种艾美耳球虫孢子化卵囊a 为巨型艾美耳球虫，b 为布氏艾美耳球虫，c 为柔嫩艾美耳球虫，d 为毒害艾美耳球虫,e 为早熟艾美耳球虫，f 为堆形艾美耳球虫，g 为和缓艾美耳球虫图 9 家兔 11 种艾美耳球虫孢子化卵囊1 为小型艾美耳球虫，2 为斯氏艾美耳球虫，3 为无残艾美耳球虫， 4 为大型艾美耳球虫,5 为穿孔
16、艾美耳球虫，6 为中型艾美耳球虫，7 为维氏艾美耳球虫，8 为盲肠艾美耳球虫，9 为肠艾美耳球虫，10 为黄艾美耳球虫，11 为犁形艾美耳球虫 A B C2、盲肠病变记分标准在药物治疗试验或疫苗保护效果评价试验中，盲肠病变记分用来评价柔嫩艾美耳球虫感染病变的严重性。在接种后第 7 天，断颈处死所有试验鸡，按照Johnson 和 Reid(1970)设计标准进行盲肠病变记分，两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准：0 分：无肉眼病变；1 分：盲肠壁有很少量散在出血点，肠壁不增厚，内容物正常；2 分：病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚；3 分：盲肠内有多量血液或有盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样块状物） ，盲肠壁增厚明显，盲肠内粪便量少；4 分：因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含粪渣或不含，死亡鸡只记 4 分。
