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1、 1 Leica TCS SP5 简明操作规程简明操作规程 一、开机一、开机 1. 依次打开电脑桌右侧“PC Microscope”、“Scanner Power”及“Laser Power”三个圆形按钮，然后将“Laser Power” 按钮右侧的激光开关钥匙（Laser Emission）顺时针旋转 90 度至“On-1”位置。如图 1-1。记录开机时间。 图 1-1 SP5 系统开关 2. 打开显微镜电源(如图 1-2)，及荧光电源。 荧光系统若以汞灯为光源，参照图 1-3；若以金属卤素灯为光源，参照图 1-4。如有必要，记录荧光灯使用 时间。 图 1-2 显微镜电源(1.指示灯；2.电
2、源开关) 图 1-3 汞灯电源(1.电源开关；2.汞灯使用时间显示) 2 图 1-4 EL6000 荧光电源(1.电源开关；2.使用时间显示；3.光闸；4.光强控制) 3. 双击电脑显示屏桌面上的“LAS AF”图标启动徕卡共聚焦软件。如图 1-5。 图 1-5 LAS AF 图标 4. 如需使用快扫系统，在“Activate Resonant Scanner”选项前打勾。如图 1-6。 图 1-6 快扫或高分辨成像系统模式 5. 点击“OK”以打开软件。如图 1-7。 图 1-7 LAS AF 启动界面 系统自检完毕后，显示 LAS AF 基本界面。如图 1-8。 3 图 1-8 LAS A
3、F 基本界面 4 二、在显微镜下观察样品二、在显微镜下观察样品 1. 选择合适的物镜，可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，如图 2-1，或软件中的“Objectives”键进行选择，如 图 2-2。 图 2-1 显微镜主机右侧部分(1. 调焦按钮；2. 物镜转换按钮) 图 2-2 通过软件选择物镜 2. 将样品置于载物台上，在明场条件下选择合适的视野。通过显微镜主机右侧的调焦按钮或旋钮调节至合适的 z 轴平面，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。如图 2-3。 2 5 图 2-3 显微镜主机左侧部分功能键 (1.透射与反射切换；2.孔径光阑调节；3.光强调节；4.视场光阑调节) 3.
4、 按“TL/IL”功能键转换至荧光观察方法， 通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块， 进行样品的荧光观察。 如图 2-4。 图 2-4 显微镜前面板 (红线所示为荧光滤块选择按钮，红色椭圆所示为荧光光闸按钮) 4. 观察完毕后，按显微镜前面板上的“SHUTTER”键以保护样品。如图 2-4。 6 三、采集共聚焦图像三、采集共聚焦图像 1. 点击工具栏下方的“Configuration”，再点击“Laser”，用?打开所需激光。如需使用 Ar 离子激光，拖动滑块调 节激光输出功率。如图 3-1。 图 3-1 激光的选择 表 3-1 常用激光及其波长 激光激光 波长波长 405 Diode 4
5、05 nm Argon 458,476,488,(496),514 nm HeNe 543 543 nm DPSS 561 561 nm HeNe 633 633 nm 2. 点击“Aquire”进行光路设置。 调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置(激光及其输出功率、分光镜、检测波 长范围、PMT gain 及 offset)，常用的荧光染料都已包含在内。选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进 行优化(如后述)，并以新的名称保存。 修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选 PMT、调节 PMT 检测范围、
6、调节 PMT 的 gain 或 offset 等。如图 3-2。 建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。如图 3-2，选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、PMT 及检 测波长范围。 7 图 3-2 光路设置 3. 透射光检测器的选择 单击“Additional Channels”以显示透射光检测器(PMT Trans)，选择观察方法(BF、DIC 等)。如图 3-3。 图 3-3 透射光观察方法及检测器 4. 选择扫描模式 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择扫描模式(Acquisition Mode)，如图 3-4。 默认模式为 xyz 扫描，是最常用的扫描模式，可
7、用于 xy 扫描和 z 轴层切(xyz 扫描)。还可在下拉菜单中选择 由 x，y，z，t (时间)以及 (波长)组合而成的多维扫描模式，如 xzy，xyt，xy，xyzt，xyz，xyzt 等。 图 3-4 扫描模式 点击并在下拉菜单中选择扫描模式 点击并在下拉菜单 中选择观察方法 点击(?)以激活透射光检测器 已有设置 可选择的激光光源 (开 关) 调节激光输出功率的滑块 调节各PMT检测范围的滑块 (双击可显示波长范围数值) PMT所用伪彩 (单击可改变当前选项) 系统已保存的荧光染料名称， 选择后可显示发 射波长范围 用 ? 激活所需PMT 8 5. 设置扫描参数 在“Acquire”菜
8、单栏的“Acquisition”中设置扫描参数， 包括分辨率(format)、 扫描速度(speed)、 针孔大小(pinhole size)、线平均(line average)、面平均(frame average)、累加(accumulation)及放大倍数(zoom)等。如图 3-5。 图 3-5 扫描参数的设置 分辨率分辨率：默认值为 512512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间 也越长。 扫描速度扫描速度：默认值为 400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描(Bidirectional X) 来达到更高速度，这时可能需
9、要进行相位校准(Phase correction)。 针孔大小：针孔大小：默认值为 1Airy。如果样品的荧光非常弱，可通过增大针孔直径来增加信号强度，所获取图像的光切 厚度也会随之增加。 平均平均：用于降低背景噪音。分为线平均(Line average)和面平均(Frame average)，线平均较快。可在下拉菜单中选 择平均的次数。两种平均方式可结合使用。 累加累加：仅用于荧光非常弱的样品。 6. 预览图像 点击“Live”以设定的扫描参数预览图像，图像将显示在右侧的显示屏上。如图 3-6 及 1-8。 图 3-6 预览图像 7. 优化扫描参数 预览图像时，调节 z 轴位置找到最适合观察
10、的焦平面，并调节 PMT 的电压值(Smart gain)及偏移值(Smart offset)，或激光输出功率，使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。如图 3-7。 单击箭头以显示完整菜单 各参数设置界面 9 图 3-7 控制面板 理想的荧光图像中应该只有少数象素点达到饱和(即灰度值为255)， 可通过位于图像左侧的LUT按钮 进 行观察。LUT 按钮可在 LUT (即指定的荧光颜色，也称伪彩)、“Glow Over Under (GlowOU)”和灰度图三档之间切 换。在 GlowOU 模式中，灰度值为 255 的象素点显示为蓝色，而灰度值为 0 的象素点显示为绿色。调节 P
11、MT 电 压值使图像中仅少数象素点呈蓝色。应使用较低的激光输出功率和较高的 PMT 电压值，这有助于保护样品免受 光漂白的影响。通过调节 PMT 偏移值来降低图像的背景。荧光图像 PMT 偏移的默认值为 0%，通常应将其调为 负值以使图像背景呈绿色。 调节过程中不应使其大于 0%。 图 3-8b 亮度及背景值设置均未达最优化值， 调节 PMT 电压值及偏移值后，达到图 3-8c 中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。 对透射光图像，同样可以调节透射光 PMT 的电压和偏移值来进行优化，有时可将偏移值调至高于 0%以增 加对比度。 图像调至满意后，单击“Stop”终止预览过程。 a 伪彩模式
12、b GlowOU 模式，图像未优化 c GlowOU 模式，图像已调至最佳状态 图 3-8 调节 PMT 电压值及偏移值前后的图像 对于双重或多重染色的样品，可选择同时扫描或序列扫描的方式。 如果两种或多种荧光探针的强度相当且交叉激发不严重，则可通过调节激光功率、PMT 电压值和接收波长 范围来避免串色。下面以 GFP 和 Cy3 双染为例来介绍双通道同时扫描时如何有效避免串色。 1) 只用 488nm 激光激发，用 2 个 PMT 同时接收荧光信号，范围可设为 500-530nm(GFP 通道)及 560-600nm(Cy3 通道)。在可获得良好 GFP 信号的前提下，尽量降低 488nm
13、激光的功率，从而减少串色到 Cy3 通道内的 GFP 信 号，同时调低 560-600nm 的 PMT 电压值至 Cy3 通道几乎看不到光信号为止。 2)打开 543nm 激光并逐渐增加其功率直至获得满意的 Cy3 通道图像，此时该通道接收到的信号完全为 543nm 激 光激发 Cy3 的结果。注意，在此过程中不要改变 PMT 的电压值。 3) 对于三重染色样品，在调整好两个较短波长通道后，再继续调节最长波长通道的激光功率、PMT 电压值和接 收波长范围。 若荧光探针强度不平衡，且短波长光明显强于长波长光，则需使用序列扫描，或在采图完毕后使用 ProcessDye Separation 来进行
14、串色分离。 若荧光探针之间存在严重的交叉激发，必需使用”Dye Separation”来进行串色分离。 Smart GainSmart Offset Z Position 10 8. 采集图像 对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“Capture Image”采集图像。对于序列扫描，或多维图像扫描， 单击”Start”进行图像采集。如图 3-9。在此之前可改变扫描分辨率、线/面平均次数等扫描参数。 图 3-9 采集图像 通常情况下，预览图像时选择 512512 的分辨率、400Hz 的扫描线速度。 而采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力，根据 Nyquist 采样原则，像素点大小(Pix
15、el Size)最好达到物镜 侧向分辨率的一半数值。 物镜分辨率可从 ConfigurationObjective 界面读取。 像素点大小可在采图参数设置界面 获得，如图 3-10。像素点随扫描分辨率增大和放大倍数增加而减小。 图 3-10 像素点大小 因此，建议按照表 3-2 设置参数，以获取高质量图像。 表 3-2 部分采图参数的建议值 物镜物镜 数值孔径数值孔径 扫描分辨率扫描分辨率 扫描线速度扫描线速度(Hz) 放大倍数放大倍数(zoom) 10 0.4 20482048 100 3 20 0.7 10241024 200 5 40 0.85 10241024 200 3 63 1.4
16、 10241024 200 3 11 四、序列扫描四、序列扫描 如果样品采用两种或以上荧光染料标记，为避免串色对实验结果的影响，可采用序列扫描的方式。 1. 单击“Acquisition”中的“seq”按钮，如图 4-1，软件界面中将出现如图 4-2 的序列扫描菜单，可通过“Scan 1”右侧 的“+”添加更多的扫描序列(“Scan 2”，“Scan 3”)。 图 4-1 序列扫描按钮 图 4-2 序列扫描菜单 2. 调用所需的单一采图设置，预览并优化参数至满意后，点击“Scan 1”将参数定义至第一扫描序列。 3. 同法定义“Scan 2”及更多的序列。 4. 扫描顺序“between lines”适合大多数的应用，特别是活细胞成像。 5. 调整分辨率、线/面平均次数等扫描参数后，点击“Start”进行序列图像的采集。 6. 可保存序列扫描的设置以便将来调用。 12 五、五、z 轴层切轴层切 (xyz 扫描扫描) z 轴层切用于观察样品中目标的空间分布。 图 5-1 xyz 扫描 1. xyz 扫描模
