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2、的方法本文内容： 摘要：目的：建立HPLC同时测定杭菊叶中5种绿原酸类成分及木犀草苷的方法，并分析不同生长过程杭菊叶中绿原酸类和黄酮类成分的动态变化，比较同期采收的杭菊叶与杭菊花中成分的差异，为杭菊叶的质量控制、合理利用提供参考。方法：采摘不同生长时期的杭菊叶样品及盛花期的杭菊花样品，采用HPLC方法对杭菊叶及杭菊花中绿原酸类及黄酮类成分进行检测。结果：不同生长时期杭菊叶中绿原酸类及木犀草苷成分呈不同的规律。新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B随着生长时间而逐渐累积，到9月含量达到峰值后逐步下降；绿原酸、异绿原酸A则随着成分累积，在9月达到峰值，下降后又在11月出现次峰值。木犀草苷则随着生长过程逐步
3、增加，到11月达到含量峰值。同期采收的杭菊叶中绿原酸类及黄酮类成分高于杭菊花。结论：该研究结果为确定杭菊叶的采收时间及质量测定标准提供了参考和依据，为揭示杭菊叶生长过程中资源性化学成分的变化以及药材品质的控制奠定了一定基础。 关键词：杭菊叶；绿原酸；黄酮；生长过程；动态变化； 杭白菊又称杭菊，是菊科植物ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，具有散风清热，平肝明目、清热解毒功效1,是着名的浙江道地药材“浙八味”之一。杭菊在采收的同时，会产生大量的茎、叶，并且产量比菊花大的多，这些茎、叶往往被视作副产品丢弃，而菊叶具有清肝明目、解毒消肿等功效，可用于头风、目眩、
4、疔疮、痈肿等证2,具有一定的药用价值。杭菊叶中尚含有大量有机酸、黄酮等成分，其中绿原酸类成分含量较高，包括单咖啡酰基奎宁酸：绿原酸（3-O-咖啡酰基奎宁酸）、新绿原酸（5-O-咖啡酰基奎宁酸）、隐绿原酸（4-O-咖啡酰基奎宁酸），二咖啡酰基奎宁酸：异绿原酸A（3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸）、异绿原酸B（3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸）、异绿原酸C（4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸），具有抗诱变、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化、降血压血脂等多种生物活性3,4. 杭菊为浙江道地药材，主产于桐乡等地，杭菊叶资源丰富，为了合理开发和综合利用杭菊叶，本文建立了HPLC同时测定菊叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸
5、、异绿原酸A、异绿原酸B、木犀草苷的方法；分析了杭菊叶不同生长过程中绿原酸类成分与木犀草苷的变化趋势；并比较了同期采收的杭菊叶与杭菊花中绿原酸类成分与木犀草苷的含量差异，以期为确定杭菊叶的采收时间、质量控制、资源综合利用提供科学依据。 1材料 1.1仪器 ThermoU3000型高效液相色谱仪，1/10万电子天平（SartoriusR200D）；B3200S-T超声机（必能信超声有限公司）；Simplicity纯水仪（美国密理博公司）. 1.2试药 新绿原酸（15012821）、绿原酸（14111207）、隐绿原酸（15020603）、异绿原酸A（13041309）、异绿原酸B（1504221
6、0）、木犀草苷（13100904）购自成都普瑞法科技开发有限公司，其纯度均98%. 甲醇（色谱纯140405）购于天津四友，水为超纯水（自制），甲醇、磷酸均为分析纯。 杭菊叶及杭菊花样品采自金华职业技术学院百草园，经金华职业技术学院医学院罗国海副教授鉴定为菊科植物ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序和叶。采收后的杭菊叶采用自然干燥方法干燥，杭菊花采用蒸晒方式进行干燥。 2方法与结果 2.1色谱条件 色谱柱为ThermoSyncronisC18柱（4.6mm250mm,5m）；流动相：A相为甲醇，B相为体积分数0.1%磷酸水，梯度洗脱程序详见表1.流速为1ml
7、min-1;波长为325nm;柱温为30；进样量为5L. 2.2溶液制备 2.2.1对照品溶液的配制 分别取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1mL含新绿原酸0.102mg、绿原酸0.166mg、隐绿原酸0.010mg、异绿原酸A0.063mg、异绿原酸B0.0405mg、木犀草苷0.0632mg的溶液，即得。 2.2.2供试品溶液的制备 取杭菊叶及杭菊花（于20XX年11月21号采摘，下同）干燥粉末（过40目筛）各0.20g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的甲醇20mL,称定重量，超声处理30
8、min（300W,45Hz），放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 对照品和供试品的色谱图见图1,2和图3. 2.3方法学考察 2.3.1线性关系考察 精密吸取各对照品溶液1,3,5,7,10L注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以各对照品进样质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2. 2.3.2精密度试验 精密吸取杭菊叶样品（20XX1121）供试品溶液5L,按上述色谱条件，连续进样5次，分别测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、木犀草苷的峰面积，结果6种成分峰面积的RSD分别
9、为0.37%、0.40%、0.28%、0.74%、0.32%和0.54%,表明精密度良好。 2.3.3重复性试验 取同一批次的杭菊叶样品（20XX1121）5份，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取5L,注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件记录色谱图，测定6种成分的质量分数。结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、木犀草苷平均含量分别为0.70%、1.57%、0.15%、0.28%、3.10%和0.50%,RSD分别为1.04%、0.83%、1.48%、1.66%、1.27%和1.53%,表明试验方法重复性良好。 2.3.4稳定性试验 分别在0,
10、2,4,8,12,24h精密吸取同一供试品（20XX1121）溶液5L,注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、木犀草苷峰面积的RSD分别为0.75%、0.86%、0.43%、0.98%、0.77%和0.41%,表明6种成分在24h内稳定性良好。 2.3.5加样回收率 取已知6种成分含量的样品粉末五份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定6种成分的含量，计算回收率，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、木犀草苷的回收率分别为，100.7%、99.1%、99.7%、10
11、1.2%、100.8%和99.8%,RSD分别为2.4%、1.6%、2.8%、2.0%、1.6%和1.8%. 2.4杭菊叶生长过程中5种绿原酸成分及总绿原酸动态变化 按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法和色谱条件对所收集的不同生长时期的杭菊叶样品中的绿原酸类成分进行测定，计算含量，结果见表4、图4、图5. 对4月至11月杭菊叶整个生长过程中采收的杭菊叶样品中5种绿原酸类成分进行了测定，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸A含量范围分别为0.41%1.13%、1.33%2.84%、0.04%0.20%、0.12%0.40%和2.75%3.89%,平均含量为0.70%、1.80%、
12、0.12%、0.24%和3.29%.5种绿原酸类成分含量由高到低依次为异绿原酸A、绿原酸、新绿原酸、异绿原酸B、隐绿原酸。 杭菊叶中的新绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸B均呈现先升高后降低的趋势，且均以9月份采收为最高；而绿原酸和异绿原酸A则以4月份植物初长叶时含量最高，其后5月份剧烈下降，再平稳、缓慢上升，至11月份达到次高值。而绿原酸类总成分含量亦呈现初始较高、降低后升高、再降低的趋势，以4月份采收的杭菊叶中绿原酸类成分总含量最高，达7.48%;9月份次之，达6.65%. 2.5杭菊叶生长过程中木犀草苷动态变化 按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法和色谱条件对所收集的不同生长时期的杭菊叶样品
13、中的木犀草苷含量进行测定，结果见图6. 木犀草苷以4月份植物初长叶时含量较高，5月后含量下降，然后慢慢增加，至11月份含量最高。 2.6同期采收的杭菊叶与花绿原酸类成分及木犀草苷的比较 按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法和色谱条件对11月同期采收的杭菊叶和杭菊花样品进行测定，计算含量，结果见表5、图7. 结果显示，在同期采收的杭菊叶与杭菊花绿原酸类成分中，隐绿原酸与异绿原酸B相近，而新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A含量杭菊叶则比杭菊花高出约36倍。黄酮类成分中，杭菊叶的木犀草苷含量也较杭菊花高出3倍左右。 3讨论 本实验对杭菊叶中5种绿原酸类成分及木犀草苷的测定方法进行了研究，实验所确定的方法可以一次性同时测定6种成分，且简便、准确，有效地揭示了不同生长时期杭菊叶中绿原酸类成分及黄酮类成分的动态变化，可用于杭菊叶的质量控制。
