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1、一、实验目的,通过本实验让学生掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法,二、实验原理,限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由46个核苷酸组成的特定序列 多种细菌能合成限制性内切酶,这是它们保护自己,降解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击,而外源DNA一旦进入细胞则立即被识别,双股DNA螺旋都被切断,这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具,常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活
2、性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:型、型和型,型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等 型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核
3、苷酸的。型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式: 粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为: 5 GAA|TTC 3 3 C T T|AAG .5 |表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序。 表示在双链上交错切割的位置,切割后生成两个DNA片段,各有一个单链末端,两条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”,平头末端:型酶切割方式的另一种是
4、在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是: 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成两种片段,片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来 型限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆 影响限制性内切酶活性的因素: DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值,双酶切的两种酶介绍,Xho酶(TaKaRa公司) 识别序列和切割位点: EcoR酶(TaKaRa公司) 识别序列和切割位点:,三、仪器、材料与试剂,水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 R-pGEX-4T-1质粒DNA Xho酶 EcoR酶 10H Buffer 无菌水 小离心管,四、实验步骤,质粒DNA的双酶切 反应体系: 反应条件:温度37,酶切1.5h 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 紫外线投射仪观察结果 UVP凝胶成像系统记录结果(电泳图),五、思考题,型限制性内切酶识别序列的特点是什么?这种酶的切割有两种方式,两种切割方式分别产生怎样的末端? 影响限制性内切酶活性的因素有哪些?,?,