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1、实验报告一、 实验目的掌握木薯分酒精发酵的基本过程与主要参数的测定方法。熟悉基本仪器的工作原理和使用方法二、实验原理酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。酒精发酵的类型有 3 种：即通过 EMP 途径的酵母菌酒精发酵、通过 HMP 途径的细菌酒精发酵和通过 ED 途径的细菌酒精发酵酵母菌通过 EMP 途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性下，丙酮酸则继续分解为乙醇。淀粉类原料的酒精发酵主要有先糖化后发酵工艺和边糖化变发酵工艺（即同步糖化发酵工艺）2 种，前者发酵时间长、酒精浓度低；后者发酵时间短，酒精浓度高，而且由于没有终产物抑制，糖化酶用量也较少，因此该工艺是酒精发酵研
2、究的重要方向之一。本实验即采用的是同步糖化发酵工艺。液化酶即 -淀粉酶，可将淀粉液化成糊精及少量麦芽糖和葡萄糖。糖化酶是一种淀粉外切酶，能把淀粉从非还原性未端水解 a-1.4 葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解 a-1.6 葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放 -D-葡萄糖。三、实验材料1、菌种酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）GGSF162、培养基斜面菌种保藏培养基：葡萄糖 20g/L,酵母浸膏 10g/L，蛋白胨 20g/L，琼脂 20g/L，加水溶解，自然 pH，于 121下蒸汽灭菌 30min。一级种子培养基：葡萄糖 20g/L,
3、酵母浸膏 10g/L，蛋白胨 20g/L，自然pH，于 121下蒸汽灭菌 30min。二级种子培养基：葡萄糖 20g/L,酵母浸膏 10g/L，蛋白胨 20g/L，pH 值自然，于 121下蒸汽灭菌 30min。发酵培养基：量取初始全渣总糖浓度 291.48g/L 和滤液总糖浓度295.57g/L 的木薯粉浆液 ml，接种前加入用过滤膜过滤的尿素溶液，添加量为3.0g/L。3、主要仪器标准筛 40 目、立式压力蒸汽灭菌器、低速台式大容量离心机、全温度恒温调速摇瓶柜、台式冷冻离心机、生物传感分析仪 SBA-40C、分光光度计、酸度计、漩涡混合器、Motic 数码生物镜、灭菌锅、3000ml 三角
4、瓶 2 个、500ml 三角瓶 11 个、万用电炉、0.5-10ul 移液枪、100-1000ul 移液枪、1000-5000ul 移液枪、酸式滴定管 25ml。4、溶液及试剂菲林甲液（CuSO 45H2O）：称取 69.3g CuSO45H2O，加入蒸馏水定容至1000ml；菲林乙液：（C 4O6H4KNa）：称取 346.0g C4O6H4KNa 和 100.0gNaOH，加入蒸馏水定容至 1000ml；2.5g/L 的标准葡萄糖溶液：称取在 102左右条件下，烘烤 4h 的葡萄糖2.5g（精确至 0.0002g）加入蒸馏水定容至 1000ml，12h 之后可以使用；2mol/L HCl
5、溶液：浓盐酸 5.6mL，定容至 100mL 容量瓶中；质量分数为 20%的 HCl 溶液：浓盐酸 514mL，加入蒸馏水定容至 1000mL 容量瓶中；200g/LNaOH 溶液：称取 200g 氢氧化钠，加入蒸馏水定容于 1000mL 容量瓶中；2mol/L NaOH 溶液：称取 8g 氢氧化钠，加入蒸馏水定容于 100mL 容量瓶中；3g/L 尿素：称取 3g 尿素，加入蒸馏水定容于 1000mL 容量瓶中；2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液：用电子分析天平准确称取次甲基蓝和二水合柠檬酸三钠分别为 10mg 和 2g，用蒸馏水溶解并定容至 100ml。四、实验步骤称取过 40 目筛或 80
6、目筛干燥的木薯粉 1453g，以料水比 1：2 的比例加入2906g60的蒸馏水，按 10U/g 木薯粉的量加入 40000U/ml 液化酶 400uL，搅拌混匀后于 60下保温 30min 并不停搅拌。转入灭菌锅中迅速升温到 95，保温液化 1h，期间不停搅拌，尽量不要让木薯粉浓醪中的固体颗粒粘连于容器壁上。然后降温至 50-60，取 10ml 全渣液备用测总糖，将液化后的全渣液过滤，制的滤液测总糖。根据测得滤液的总糖浓度调滤液的总糖浓度至 270g/L，于121下灭菌 30min，然后冷却至 33左右。按 250U/g 木薯粉的量加入100000U 的糖化酶。按接种量为 10接种酿酒酵母
7、GGSF16 至液化糖化后的醪液中，同时加入 3g/L 尿素，分别取样 10mL 置于两个三角瓶中用于测定初总糖和初还原糖。余下的分装到 10 三角瓶，每瓶约 300ml，分别接上发酵栓，并于33发酵，转速为 160r/min，摇床培养 72h，期间每隔 6h 取样分析。发酵结束后，测定细胞数、OD 值、总糖含量、还原糖含量、酒精度、葡萄糖含量。木薯粉酒精发酵工艺流程图如下木薯粉 过筛 称重 调浆升温液化 降温全渣液化液滤液过滤测总糖调总糖 灭菌 降温 接种 10%摇瓶发酵 过程取样分析总糖还原糖酒精葡萄糖OD 值1453g液化酶400ul加水2906g95 1h270g/L/121 30mi
8、n 33尿素 3g/L糖化酶250u/mL300ml/瓶(5-6) 瓶 33 160r/min细胞数50-600 6 12 18 2430 36 36 42 4652 56 60 66 72单位:h图 4-1 木薯粉酒精发酵工艺流程图Fig.4-1 the process flow diagram of cassawa starch ethanol fermentation五、实验检测方法1、测总糖(1)原理本次试验采用的测总糖的方法是斐林试剂法，因此直接滴定前需要在试样加入盐酸并在加热条件下使试样中非还原糖部分酸解为还原性糖。菲林试剂是由甲、乙两种溶液组成。甲液含质量分数为 0.05 g/m
9、L 的硫酸铜和次甲基蓝(氧化还原指示剂)；乙液含质量分数为 0.1 g/mL 的氢氧化钠，酒石酸钠。将一定量的碱性酒石酸铜甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的酒石酸钾钠铜。在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，还原糖则被氧化和降解。反应生成的氧化亚铜沉淀。滴定时以亚甲基蓝为氧化还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含
10、量。(2)步骤试样制备称取 10mL 过滤液试样于 250mL 三角瓶中，加 70mL 蒸馏水和 20mL 质量分数为20%的 HCl 溶液，沸水浴中水解 60min，冰水迅速冷却，以 200g/L 的 NaOH 溶液中和到微酸性 pH 为 5-6 之间，加入蒸馏水定容到 250mL，振荡摇匀，倒入离心管中，以 4000r/min 的转速离心 10min，取滤液备用。斐林试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积标定A. 预备试验： 吸取斐林甲液、乙液及标准葡萄糖液各 5mL 于 250mL 三角瓶内，加 20mL 蒸馏水，摇匀，在电炉上加热，从沸腾开始计时约 2min，加入亚甲基蓝溶液 2 滴，在沸腾状
11、态下 1min 内用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积。B. 正式试验：吸取斐林甲液、乙液及标准葡萄糖液各 5mL 于 250mL 三角瓶内，加蒸馏水 20mL，滴入少于预备试验 1 毫升的 2.5g/L 的标准葡萄糖溶液，置电炉上沸腾 2min，滴入亚甲基蓝 2 滴，沸腾状态下 1min 内以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在 0.1mL 之内。试样总糖的测定A.预备试验： 吸取斐林甲液、乙液及待测液各 5mL 于 250mL 三角瓶内，加20mL 蒸馏水，摇匀，在电炉上加热沸腾，2min 后加入
12、亚甲基蓝溶液 2 滴，在沸腾状态下 1min 内用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积。B.正式试验：吸取斐林甲液、乙液及待测液各 5mL 于 250mL 三角瓶内，加蒸馏水 20mL，加入少于预备试验 1 毫升的 2.5g/L 标准葡萄糖溶液，置电炉上沸腾 2min，滴入亚甲基兰 2 滴，沸腾状态下 1min 内以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在 0.1mL 之内。(3)计算公式总糖含量（以葡萄糖计，g/L）=（A-B）0.0025250 15 110式中：A标定 10ml 菲林试剂所消耗的标
13、准葡萄糖溶液的体积，mL；B往 10ml 菲林试剂中加入 5ml 水解后试样消耗标准葡萄糖溶液的体积，mL；5定糖时，用移液管吸取 5ml 试样水解液的体积，mL；2.5实验前配制好的标准葡萄糖溶液的浓度，g/L；250试样水解液的定容体积，mL；10取木薯粉浆液化滤液的体积，mL2、测还原糖本实验仍然采用斐林试剂法测定过滤液中的还原糖，因此不需要对过滤液进行酸解，原理与计算方法如上（1） 试样的制备称取糖化醪试样 10mL 加蒸馏水定容至 250mL，振荡摇匀，倒入离心管中，以 4000r/min 的转速离心 10min，取滤液备用。（2）试样还原糖的测定预备试验：同总糖的测定。正式试验：同
14、总糖的测定。3、细胞数(1)原理：用血球计数板在在显微镜下直接技术是一种常用的微生物技术方法，本次试验采用的是三目生物显微镜，可以将显微镜观测到的细胞成像在电脑上，方便计数，提高效率。血球计数板是一块特质的厚玻璃，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网分有九个大方格，中间的大方格是计数室，计数室的规格有两种，本次试验采用的是 25 个中方格，每个中方格有 16 个小方格，其中位于正中及四个角的中方格是细胞计数区域，计数室由 400 个方格组成，面积为1mm2, 每个小方格的面积为 1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0
15、.1mm，所以每个计数区的体积为 0.1mm3，每个小方格的体积为 1/4000mm3。(2)步骤:1.将离心管内的过滤液稀释至容易计数的浓度，一般一个小方格内 510个细胞为宜。如将 12h 的过滤液试样稀释 10 倍是用移液枪取 100ul 试样放入装有 900ul 蒸馏水的离心管中，然后将离心管放在振荡器振荡 1min。混合均匀后取 100ul 稀释后试样与 100ul 美兰再次混合即稀释至 20 倍。2. 取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。将稀释好的过滤液摇匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多） ，让稀释液利用液体的表面
16、张力充满计数区，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余液体，注意不能有气泡产生。3. 静置片刻，使酵母细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。4.找到计数室后按如下图所示数字与箭头顺序用电脑拍下每个中方格图片（尽量拍下完整的中方格） 。图片拍完后，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。5.数图片中的酵母细胞数：在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数 2-
