园艺植物组织培养-第3章

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1、2019/8/6,Huo XW, IMAU,1,OUTLINE,培养基成分 培养基种类 培养基配制 培养基的设计,第一节 培养基的成分 培养基(Medium): 是植物组织培养的重要基质. 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求. 同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同. 没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官. 在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功.,一、培养基的成分,培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合 物、培养体的支持材料等五大类。 1水 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发

2、霉变质。 2、无机元素(inorganic nutrition ) 大量元素，指浓度大于0.5mmolL的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。其作用是：,(1)N:蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。 氮（N）：细胞中核酸的组成部分，也是生物体许多酶的成分，氮被植物吸收后转化为氨基酸再转化为蛋白质，然后被植物利用。 氮还是叶绿素、维生素和植物激素的组成成分。 氮主要以铵态氮、销态氮两种形式被使用，实际中常常将两者混合使用，以调节培养基中的离子平衡，利于细胞的生长发育。有KN03、NH4NO3，Ca(NO3)2等。 一般认为，铵态氮的含量超过8 mmolL-1时容易伤害

3、培养物，但这种情况也依植物种类、培养部位、培养类型而定。,(2)P: 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。 磷也是ATP、ADP等的组成成分。 促进对N的吸收。 参与植物生命活动中核酸和蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量的储存、转化与释放等重要的生理生化过程，增强植物的抗逆能力，促进早熟。 组织培养过程中需大量的磷。磷常以盐的形式供给。 常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。,(3)K： 许多酶的活化剂。 促进器官和不定胚的分化， 促进叶绿体ATP的合成， 增强植物的光合作用和产物的运输， 能调节植物细胞水势， 调控气孔运动， 提高植物的抗逆能力。 浓度不易过大

4、，一般为1-3mgL为好。 制备培养基时，常以KCl、KNO3，等盐类提供。,(4)Mg、S和Ca： Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂； S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。 它们常以MgS047H20提供。 用量为1-3mgL较为适宜。 Ca是构成细胞壁的一种成分。 Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H20提供。,(5)微量元素 指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 在制做培养基时用Fe

5、S047H20和Na2-EDTA结合成螯合物使用，避免Fe2+氧化产生Fe(OH)3沉淀。,硼能促进生殖器官的正常发育，参与蛋白质合成或糖类运输，可调节和稳定细胞壁结构，促进细胞伸长和细胞分裂； 锰参与植物的光合作用、呼吸代谢过程，影响根系生长，对维生素C的形成以及加强茎的机械组织优良好作用； 锌是各种酶的构成要素，增强光合作用效率，参与生长素的代谢，促进生殖器官发育和提高抗逆性； 铜能促进花器官的发育； 钼是氮素代谢的重要元素，参与繁殖器官的建成。,缺素症： 当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。 缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管； 缺铁，细胞停止分裂； 缺硫

6、，表现出非常明显的褪绿； 缺锰或钼，则影响细胞的伸长。,3有机化合物(organic compound),培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。 常加入的有机成分主要有以下几类： (1)碳水化合物（carbohydrate） 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。 蔗糖使用浓度在2-3，常用3，胚培养时采用4-15的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。 不同植物不同组织的糖类需要量也不同， 高压灭菌时一部分糖

7、发生分解。 在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。,(2)维生素(vitamin) 在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。 大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但数量上不足，通常需加入一至数种维生素。 主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、B5(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素(维生素H)、叶酸（维生素M）、VB2(核黄素)等。一般用量为0.1-1.O mgL。 VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用，用量为1-100 mgL

8、。,(3)肌醇 (inositol): 又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。 用于构建细胞壁,参与细胞膜的构建。 使用浓度一般为50-lOOmgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。 对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,(4)氨基酸(amino acide) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 有时应用水解乳蛋白（LH）或水解酪蛋白（CH），是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mgL之间。,(5)天然复合物: 1)椰乳

9、 是椰子的液体胚乳。使用浓度在10-20，它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。 2)香蕉汁 用量为150-200mg/L。对pH值的缓冲作用大,对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) :用量为150-200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 4)水解酪蛋白: 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100-200mgL。 5)其他: 酵母提取液(YE)(0.01-005)，主要成分为氨基酸和维生素类.,4植物激素(hormone) 是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽少，但对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要的调节作用。 (1)生长素类(auxin)

10、 在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长 根对生长素最敏感,其次是茎和芽。 作用的强弱依次为2,4-DNAAIBAIAA。 生长素的使用量通常为0.05-5mg/L。,IAA(indoaceticacid吲哚乙酸:是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。 NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸):在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长 IBA(i

11、ndolebutyric acid吲哚丁酸):是促进发根能力较强的生长调节物质。 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸):起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。 生长素配制时可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用01molL的NaOH或KOH助溶。,(2)细胞分裂素类(cytokinin) : 主要功能是促进细胞分裂、抑制衰老，组织内细胞分裂素/生长素的比值高时，可诱导芽的分化。 常见的细胞分裂素有激动素（KT）、异戊烯基嘌呤（2iP）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、噻重氮苯基脲（TDZ）。 它们作用的强弱依次为TDZZT

12、2iP6-BAKT。 细胞分裂素的使用量通常为0.05-10 mgL-1。 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。 促进细胞分裂与扩大。 抑制根的分化。,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、是长根还是长芽。 促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。 一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.05-10mgL。,(3)GA(gibberellicacid赤霉素) : 有20多种，生理活性及作用的

13、种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3， 促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株； 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化； 赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。 赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，应当采用过滤灭菌法加入。,脱落酸（abscissic acid, ABA） 抑制细胞分裂和伸长，促进脱落和衰老， 促进休眠。 主要用于种质资源的超低温保存。 多胺（polyamines

14、,PA） 主要包括腐胺（Put）, 精胺（Spm）, 亚精胺（Apd）及尸胺(Cad) 是生物代谢过程中产生的小分子脂肪族含氮碱 对植物生长发育、形态建成及抗逆性有调节作用。,4、琼脂(agar) 琼脂是从红藻等海藻中提取的一种高分子碳水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，它不参与代谢、不提供营养（但不纯的琼脂中常会有一些微量元素），在植物离体培养中一直被作为首选的固化剂。 琼脂的用量一般在410g/L之间。 在离体培养中，增加琼脂的用量可以克服“玻璃化现象”的发生。 琼脂的凝固能力除与原料、厂家和加工方式有关外，还与高压灭菌的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，

15、过酸及高温会使琼脂发生水解，失去凝固能力。存放时间过久，也会逐渐失去凝固力，在使用中应注意。,5 活性碳(activated carbon)与硝酸银 活性碳（AC）可吸附植物的有害泌出物，但其对物质吸附的选择性很低，同时也能吸附某些植物的必需化合物. 活性碳的用量一般为0.53。在高压灭菌之前加入活性碳会降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固，在培养基配制时应注意。,AgNO3 离体培养中的植物组织会产生乙烯，乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至会导致培养物的衰老和落叶。 AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，能起到抑制乙烯活性的作用。 在培养基中加入

16、适量的AgNO3，有促进愈伤组织分化器官或胚状体的作用，能使某些原来再生困难的物种再生植株，并对克服试管苗玻璃化、早衰及落叶等有明显效果。 AgNO3的使用浓度一般为110mg/L。 不可把培养物长期保存在AgNO3培养基上,6、抗氧化物(antioxide) 植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。 这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。 在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用50-200 mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。 其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。,7、染色剂(stain) 在进行离体培养研究时通常需配制不同的培养基，或加入不同的植物激素，以观察培养物的变化，确定最适宜的配方。