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1、福建医科大学博士学位课题 开 题 报 告 重组hIGF-1在大肠杆菌中的制备和对阿尔茨海默病的治疗作用,博士研究生：廖联明 导 师：俞昌喜 教授,立题依据,阿尔茨海默病的药物治疗现状,阿尔茨海默病（AD），是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。 AD的主要病理特征有老年斑、神经原纤维缠结及及神经元原发变性、坏死和突触缺失。 目前用于治疗AD的药物包括AchE 抑制剂（如石杉碱甲，加兰他敏）和NMDA受体拮抗剂（如盐酸美金刚）。,这些药物均未能取得令人满意的效果，而且这些药物不能阻断神经元变性和坏死。 由于AD的发生和发展涉及许多环节，因此对AD的治疗应该是综合治疗，如
2、具有促进神经生长、抗神经元凋亡的因子，保护神经细胞免受A毒性的抗氧化剂和自由基清除剂等。,胰岛素样生长因子1,胰岛素样生长因子( insulin - like growth factor, IGF)，主要包括IGF -1和IGF -2，是一类广谱性的促生长因子，其化学结构与胰岛素原类似，为同源的单链多肽。,IGFs在正常生理活动中起着极为重要的作用,与胚胎分化、个体发育密切相关,参与糖、脂肪和蛋白质代谢。 该系统异常是糖尿病、胰岛素抵抗、内分泌紊乱、癌症、营养不良、骨骼发育不良、骨密度低等多种疾病的病因之一。 研究证实IGF-1 和IGF-1R 均广泛分布于脑组织各部位。IGF- 1 可调节神
3、经细胞的生长、发育、分化.,IGF-1促进神经细胞的增殖,在大鼠或小鼠臀肌注射IGF2或IGF1均能促进肌肉内神经神经萌芽（nerve sprout） IGF-1可以促进大鼠背根节感觉神经元的生长。 IGF-1在促进神经细胞增殖时和神经生长因子具有协同作用。,IGF- 1 抑制神经细胞凋亡,IGF- 1通过激活PI3- K/Akt 途径调节糖代谢起到抗凋亡作用。IGF-1 与IGF- 1R 结合后使PI3- K 磷酸化, 从而激活其下游分子Akt, 再通过其效应器如CAMP 应答元件结合蛋白(CREB) 、凋亡前效应蛋白等加速糖原分解, 提高血糖浓度。 IGF-1可以激活ERK 通路, 上调B
4、cl-xl 水平, 因其可抑制caspases-3 活性, 从而抑制细胞凋亡。 IGF-I 可以增加了Bcl-2 的表达, 降低caspase-3 活性从而抑制依托泊苷诱导的胶质细胞瘤细胞凋亡。 IGF-1 能降低暴露于乙醇中的小脑颗粒细胞的死亡率, IGF- 1 通过增加神经元细胞Ca2+内流激活钙依赖性一氧化氮合酶( nNOS) 产生NO, NO 激活sGC,提高cGMP 水平。,IGF-1和AD,AD患者血清IGF-1浓度明显低于正常对照人群，推测两者有一定的相关性。Carro等进一步报道报道IGF-I可促进大脑淀粉样蛋白的清除。 Adlerz报道IGF-1可以提高人SH-SY5Y 神经
5、母细胞瘤细胞中alpha-secretase对内源性APP (amyloid precursor protein)、 APLP1 (amyloid precursor-like proteins 1)和 APLP2的降解活性。,在APP/PS2突变AD小鼠模型中，给予IGF-I可以纠正小鼠异常的大脑血管，从而改善AD症状。 皮下给予IGF-I可以减轻A25-35诱导的大脑皮层神经细胞死亡。,国内外IGF-1的研发现状,美国Insmed公司开发的IGF-1为IGF-1和IGF-1结合蛋白-3的蛋白复合体。商品名为美卡舍明-林菲培(Mecasermin Rinfabate)，于2005年获得FDA
6、批准用于治疗严重原发性IGF-1缺乏患儿。 目前正在进行的2期临床研究：强直性肌肉营养不良症和肌萎缩侧索硬化症。 Tercica公司生产的IGF-1为单体，用于治疗严重原发性IGF-1缺乏患儿。 均采用基因工程大肠杆菌生产。,据查对我国药品和食品监督管理局网站的检索,目前国内还没有单位上报IGF-1，更无产品进入临床试验。,国内报道lGF-I在大脑杆菌中的表达研究不少。 方法包括非融合和融合法。 采用非融合表达的产物含甲硫氨酸，而人体天然结构的IGF-I不含甲硫氨酸，因此必须去除。而目前尚没有简单的去除甲硫氨酸的方法，因此没有实用价值。 国内学者采用的融合蛋白均需要经过酶法裂解。由于酶法裂解需
7、要的酶价格昂贵，通常只用于小量制备，不能用于大量生产。 更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。,开发IGF-1产品的依据,（1）目前对AD的药物治疗还不能满足，尤其是没有保护神经细胞，抑制神经细胞凋亡的药物。 （2）初步的体外和动物体内试验显示IGF-1保护神经细胞，抑制神经细胞凋亡的作用，尤其是在AD模型中也显示了神经保护作用。 （3）国外的IGF-1已经上市，说明了IGF-1作为治疗药物具有很好的安全性。而我国在IGF-1的开发上显然处于落后的位置，因此有必要加紧产品研发。 （4）在目前国内还没有单位对IGF-1的工业生产工艺进行深入研究的状况下，
8、我们开展此项研究可避免在不久的将来只能依靠进口该产品的局面发生，造福我国的患者，具有很大的社会和经济意义。 （5）我们的前期工作已经基本克服了国内研发单位的问题，因此有进一步研究的基础。,项目研究内容,1. IGF-1的制备,（1）构建IGF-1融合表达载体 （2）融合蛋白的纯化 （3）目的蛋白IGF-1从融合蛋白中裂解 （4）目的蛋白的纯化,2. IGF-1对AD动物模型的疗效,（1）IGF-1对铝毒性AD动物模型的疗效 （2）IGF-1对A毒性AD动物模型的疗效,3. IGF-1治疗AD的机制探索,（1）IGF-1对Tau蛋白磷酸化的影响,研究方法,扩增目的DNA,以含有IGF-1表达系列
9、的pET11质粒为模板，用PCR扩增出IGF-1全长基因序列。,引物1,包含EcorI 酶切位点（黑体），酶切位点前端2个碱基，羟胺裂解位点和IGF-1的前面6个氨基酸系列（下划线）： TTC GAA TTC AAC GGT CCG GAA ACC CTG TGC Asn Gly,引物2,包含IGF-1的后面5个氨基酸系列（下划线）,终止密码，HindIII 酶切位点，酶切位点后3个碱基，： CCG GCT AAA TCT GCT TAG AAGCTT GCG GGC CGA TTT AGA CGA ATC TTCGAA CGC,Cloning site,IGF-1 Trx-tag His-6
10、,CNBr,2. IGF-I基因的表达,PCR扩增的产物经抽提后用于酶切反应。将pET32空白质粒载体用EcoR I和HindIII双酶切后，回收大片段，同时回收用EcoR I和HindIII双酶切处理的PCR扩增的产物。将上述回收的两个DNA片段以适当比例混合，16连接过夜。将连接物转化到DH5菌中，酶切鉴定，筛选克隆。,3. IGF-1基因的序列测定,酶切鉴定后的阳性克隆进行序列测定（送Invitrogen公司)，将序列正确的克隆保存在甘油中。,IGF-1基因的表达及表达产物的免疫印迹分析,将工程菌划平皿后，挑选单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37培养过夜后，按1：100接种于诱
11、导培养基中，37培养23小时后，用1mM IPTG诱导，在不同诱导时间取样，进行SDS-PAGE分析。 将诱导表达后的重组蛋白转印至硝酸纤维素膜上，以5脱脂奶粉封闭，与一抗结合，洗涤后与二抗反应。其中，抗原抗体反应中的第一抗体为兔抗人IGF-1多抗(1：2000)，酶标第二抗体为羊抗兔IgG-HRP(1：4000)，显色。,5. 采用Ni-NTA 树脂分离融合蛋白,将上述方法确认的阳性菌接种，诱导表达，确定表达后目标蛋白的部位。收集蛋白，按树脂使用说明书将样品加到Ni层析柱中，流速控制在0.5ml/min左右，不断增加咪唑的浓度，收集穿透部分，超滤离心，SDS/PAGE分析。,6.化学法蛋白融
12、合蛋白，分离IGF-1,将树脂分离的融合蛋白超滤离心，除去各种小分子。将蛋白置下列反应体系中：蛋白5mg/ml, 羟胺2M, Tris 0.2M, pH 9.0(NaOH调), 45反应4小时。然后HCl调pH 8.0, 降温，终止反应。采用Ni-NTA 树脂,M-Sepharose蛋白层析柱分离裂解蛋白。,纯化的IGF-1的鉴定,将分离的IGF-1在透析袋中透析，除去各种小分子。透析后的透析液冷冻干燥后将蛋白复溶。 采用ELISA（同上）对纯化后蛋白的免疫源性进行再次鉴定。此外，测定纯化蛋白的N端序列，等电点。采用MALDITOF法（Matrix-Assisted Laser Desorpt
13、ion Time-of-Flight ）测定蛋白的分子量。,蛋白活性检测,参考文献，将成纤维细胞NIH3T3用含有10 小牛血清的DMEM 常规培养，将IGF-1以0.2、1、5ug/ml的终浓度加入到细胞培养液中，MTT法检测IGF-1对细胞增殖的影响。,IGF1对铝毒性拟AD小鼠模型的作用,方法：侧脑室微量注射套管埋置。术后第3天，模型组小鼠侧脑室注射AlCL3，每天1次，连续5d，对照组小鼠则相应注射等体积的人工脑脊液。 在诱导前、诱导后给予IGF1（50ug/kg/day）10天，观察IGF-1的疗效。 采用避暗法检测小鼠学习记忆功能，随后每组随机取12只小鼠断头取脑，MTST（mod
14、ified thioflavine S technique）染色法观察其中4只小鼠海马组织老年斑和神经纤维缠结形成情况。,IGF-1对诱导大鼠阿尔茨海默病模型的作用,定位双侧海马CA1区，微量进样器自脑表面定位点垂直进针，缓慢将A25-35 1ul(10g/L)注入，缝合切口 对照组注入等容积生理盐水，手术步骤同前。在诱导前、诱导后给予IGF-1（50ug/kg/day）10天，观察IGF-1的疗效。,观察试验（10）中A25-35注射后大鼠脑内磷酸化tau 蛋白水平变化及IGF-1的影响。用免疫组化法检测磷酸化tau 蛋白。,创新点,本文采用的原核表达载体pET32a(+)，其特点除了能够编
15、码6个组氨酸残基可以方便地利用Ni-NTA 树脂进行分离外，还带有大肠杆菌TrxA基因，编码109个氨基酸的硫氧还蛋白，提高了表达产物的稳定性； 目的蛋白IGF-1可以采用廉价的化学法从融合蛋白中裂解出来； 首次研究IGF-1对Tau磷酸化的影响。,拟解决的关健问题,化学裂解、纯化后的蛋白能否复性，恢复其天然结构是本研究的关键问题。,初步的实验结果,随机挑选5个转化子的PCR结果,随机挑选3个转化子的测序结果,经invitrogen公司测序，序列完全正确,tttGTTtAaCTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTG
16、ACACGGATGT ACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGG ATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAA TATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAA AGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTT CTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGAT CTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGA
