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1、第一节 细胞周期概述,“细胞周期”(cell cycle)又称“细胞分裂周期”,是指一个细胞经生长、分裂形成两个细胞所经历的全过程,即细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程。,1. G1期(gap 1 phase),2. S期(synthesis phase),3. G2期(gap 2 phase),4. M期(mitosis phase),5. G0期,Interphase (Long) G1: Cell growth S: DNA replication G2: Cell growth,M-phase= mitosis (Short) Chromosome segregation
2、 Cytokinesis,Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,第二节 细胞周期调控的关键分子,细胞周期调控的核心蛋白:,2.细胞周期蛋白(Cyclin) :Cdk的正调节因子,1.周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,Cdks):细胞周期调节的中心环节,3. Cdk抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase
3、 inhibitors, CKIs):Cdk的负调节因子,一、细胞周期蛋白(Cyclins),细胞周期蛋白(Cyclins)是一类伴随细胞周期的不同阶段表达、累积和降解的蛋白质因子。,细胞周期蛋白盒(Cyclin box): 与Cdk结合,激活Cdk的蛋白激酶活性 毁灭盒(Destruction box): 在Cyclin的自身降解中发挥重要作用,1、结构特点,2、调控机理,Cyclin与Cdk形成二聚复合体:催化亚基为Cdk,调节亚基为Cyclin。,Destruction Box in Cyclins,不同类型的CDK/cyclin复合体,Cyclin D包括D1-3,各亚型cyclin
4、D在不同细胞中的表达量不同,但具有相同的功效。,3、分类:A-H,细胞周期中不同类型cyclin的表达变化,二、周期蛋白依赖性蛋白激酶,周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cdks)是一类Ser/Thr蛋白激酶,在细胞周期的调节中起关键作用。人体细胞内主要有Cdk1/Cdc2、Cdk26、Cdk7/CAK和Cdk8等。,活性中心:ATP结合部位;催化部位 调节亚基Cyclin的结合部位:正调节 P13suc1的结合部位:负调节,阻止细胞进/退M期,1、结构特点:3个主要功能域,2、没有酶量的调节:在整个细胞周期中,某一Cdk的含量恒定,其活化Cdk与非活化Cdk的总量不变。,CdK的结构,、: 抑制性磷酸
5、化位点;cyclin结合位点;ATP结合位点 b: 催化部位 : ATP结合位点 : T-loop;活性磷酸化位点 : 自身磷酸化位点,Cyclin A,Cdk2,CDK activating,3、组成、结构调节:活化与非活化Cdk的比例,正性调节:人Cdk与特定的Cyclin 结合才有活性;也只有Cyclin降解才能使Cdk最终失活。 负性调节:CKI与Cdk结合后阻止Cdk磷酸化。 共价调节:抑制性位点磷酸化失活(Wee1激酶);去磷酸化复活(Cdc25磷酸酶)。 协调调节:人Cdc2的Thr 160/161和Thr 14/Tyr 15磷酸化,可促进Cdk-Cyclin结合。 这种磷酸化又
6、依赖Cyclin,Cyclin与Cdk的结合可导致Cdk T环的移开,暴露出其中的Thr 160/161位点 。,MPF activity controlled by: 1) cyclin B levels 2) phosphorylation of cdk1,Multiple levels of regulation provide input for “checkpoint control”,M-phase promoting factor = MPF =cdk1/cyclinB,CDK激酶(CDK activating kinase,CAK):磷酸化Thr161 Wee1激酶:磷酸化Ty
7、r15/Thr14,依赖Cyclin的蛋白激酶(Cdc/Cdk),三、Cdk抑制蛋白(CKIs),Cdk抑制蛋白是Cdk的负调节因子,拮抗Cyclin的作用,阻止细胞经过检验点 。,(1)CIP/KIP(Kinase inhibition protein)家族:广泛抑制Cdk1-, Cdk2-, Cdk4/6-Cyclin复合物。因其N端和C端分别具有不同的结构和功能,故又称双重特异家族。包括p21、p27和p57,1、CKI两大家族,(2) INK4(Inhibitor of cdk4)家族:特异性抑制Cdk4/6-D Cyclins,因其结构中含有数个具强烈疏水性的锚蛋白(ankyrin)
8、重复序列,故又称锚蛋白家族,包括p15、p16、p18和p19。,p21,p21是第一个被发现的CKI基因(1993年),其抑制作用最广泛,对细胞周期各期的Cdks均有明显的抑制作用。由于其表达蛋白质分子量为21 kD,而且最初认为它与野生型p53的生物活性有关,故命名为p21WAF-1(Wild-type p53 Activated Fragment-1);后又发现p21与细胞老化等多种因素有关,故又称p21SDL1/Cip-1/CAP20/PIC1等。,第一个被发现的CKI基因 p21定位于6p21 抑制作用最广泛 表达蛋白质分子量为21 kD,p21的功能,可能作用于细胞周期的多个环节。
9、 P21可与Cyclin、Cdk和增殖细胞核抗原(PCNA)组成四聚体。其N端结构域与Cyclin-Cdk结合,抑制Cyclin-Cdk磷酸化Rb蛋白,阻止细胞进入S期。 当细胞在S期发生DNA损伤时,p21的C末端结构域与PCNA直接结合,抑制DNA聚合酶活性,阻止损伤DNA长链的复制。但p21不能抑制DNA复制起始复合物的形成和DNA缺口的修补,所以,DNA的修复不会被抑制。 p21基因的启动子区域含有p53蛋白的结合位点。,p16,p16又称MTS1基因(Multiple tumor suppressor 1),其编码蛋白质的分子量约为16 kD,主要抑制Cdk4的活性,故命名为p16I
10、NK4A。,p16基因定位于9p21-22 其编码序列由3个外显子组成 有、两个转录本。 表达蛋白质分子量为16 kD N端含有一个与细胞周期蛋白盒N端同源的序列;还含有4个锚蛋白重复序列。 可抑制Cdk4或Cdk6的活性,使其不能对Rb磷酸化。,Cyclins-Cdks-CKIs的相互作用关系,p21 and p27 inhibit assembly and activity of cdk4,6-cyclin D and cdk2-cyclin E by CAK. They also inhibit cycle progression independent of RB activity.
11、p16 inhibits both assembly and activity of cdk4,6-cyclin D.,一、细胞周期的驱动,1、 G1期:在生长因子诱导下,Cyclin D首先被合成,于G1中期达到峰值,并与Cdk4、Cdk6结合形成Cyclin D-Cdk4或Cyclin D-Cdk6复合物(又称G1-CdkC),激活Cdk4或Cdk6的蛋白激酶活性,使Rb蛋白磷酸化。磷酸化的Rb蛋白与结合的E2F(无活性)分离,释放出有活性的E2F,E2F作为转录因子激活与DNA复制相关基因的表达,使细胞进入S期。,第三节 细胞周期的调节,positive feedback loop,Rb
12、 phosphorylation maintained until Cyclin B destruction,细胞周期的驱动,2、S期:Cyclin D降解,Cyclin E和A积累,先后与Cdk2结合为Cyclin E-Cdk2复合物(又称G1/S-CdkC)及Cyclin A-Cdk2复合物(又称S-CdkC),维持DNA复制。,3、G2期:Cyclin E降解,Cyclin B积累,并与Cdc2(Cdk1)结合,形成促成熟因子(maturation-promoting factor,MPF)复合体,即M-CdkC。细胞中的蛋白激酶将Cdc2的Tyr15和Thr14磷酸化,形成无活性的前M
13、PF (pre-MPF)。未磷酸化的活性MPF能激活磷酸酶Cdc25,将Cdc2的Tyr15和Thr14去磷酸化,从而激活更多的MPF(Cdc2的自催化过程),促使染色体浓缩,微管蛋白磷酸化,细胞骨架的重新组合,推动细胞分裂。,4、M期:Cyclin B和泛素(ubiquitin)被磷酸化。在特定酶的作用下,磷酸化的Cyclin B泛素化,然后由依赖泛素的蛋白水解酶催化降解,结果使Cdc2失去调节单位而失活,细胞回到G1期。促后期复合物(APC)对M-Cyclin及分裂期其他调控因子的泛素化和蛋白水解起重要作用。,Protein degradation is important in mito
14、sis,细胞周期驱动的核心成分是Cdks。Cyclin-Cdk复合物活性的调控决定着细胞周期的进程。,二、Cyclin-Cdk复合物的调节,结构调节:Cdk亚基的磷酸化、CKIs的结合。 数量调节:Cdk调控因子的转录调控; Cyclins的水解,主要机制:泛素依赖的蛋白质水解 限速步骤:泛素连接酶催化的泛素转移反应。 关键酶: SCF(Skp1-Cdc53/cullin-F-box protein complex)和APC (Anaphase-promoting complex,促后期复合物),泛素化并降解细胞周期调控蛋白。,The Regulation of APC in Cell Cyc
15、le,第三节 细胞周期的调节,基因调节:Cdk的时相性激活是细胞周期调控机制的核心,其主要依赖于Cyclin的细胞周期特异性或时相性表达、累积和降解。 生长因子及其受体调节 抑素调节:细胞自身产生的终止增殖的信号分子 cAMP和cGMP调节:含量随细胞周期呈周期性变化 激素调节:生长激素、雌激素等可刺激细胞生长 Ca2+和钙调素调节:高Ca2+水平直接或间接激活蛋白激酶从而调节细胞增殖活动,G1期的启动是细胞周期的关键: G1/S限制点,生长因子 (Growth factor),G1,S,G2,M,抑素 (Chalone),G1,S,G2,M,三、细胞周期检测点与细胞周期监控,细胞周期检测点(
16、check point):保证细胞周期中DNA复制和染色体分配的检测机制。细胞一旦通过了检测点,就可以完成细胞周期。这是一类负反馈调节机制。,细胞周期监控:当细胞周期进程中出现异常事件,如DNA损伤或DNA复制受阻时,检测点调节机制被激活,及时地中断细胞周期的运行。待细胞修复或排除故障后,细胞周期才能恢复运转。,Checkpoints in Eukaryotic Cell Cycle,细胞周期检测点分类,1、细胞周期检测点分类,(1)DNA损伤检测点(DNA damage checkpoint):负责检测DNA有无损伤、合成有无错误。 G1晚期检测点(G1/S转换点):关键性检测点。控制从G1期进入S期,决定细胞是进入细胞周期,或暂时滞留在G1期,或退出周期。在哺乳类动物细胞中,G1检测点称为R点或限制点(restriction point),酵母中为启动点(start)。 G2期检测点(G2/M转换点):保证细胞DNA复制的完整。,(2)DNA复制检测点(DNA replication checkpoint):负责DNA复制的进度,(3)纺锤体组装检测点(sp