常规病理检查重点

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1、常规组织病理学技术,固 定,取 材,脱水，透明，浸蜡,包 埋,切片,镜下观察，诊断,常规病理学技术（病理工作流程）,快速冰冻,取材,常规组织处理,OCT包埋,细胞学检查,取材,染色,固定,组织固定,目的： 保持组织和细胞的形态学特征，防止因为酶活性或微生物而使组织坏死，自溶及腐败。 保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。 减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失。 维持细胞膜，内质网，核膜等细胞结构的完整。,组织固定,目的： 使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。 防止细胞过度收缩或膨

2、胀而失去其原有形态结构。 经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辩认。,组织固定,固定的机制和原理有很多种，包括: 反应基团间的共价结合 交联的共价结合 脱水与酸性物质作用 盐的形成和热能 共同作用,组织固定,理想的固定剂： 保留蛋白，mRNA以及DNA的生化特征。 支持组织化学染色，免疫组化，原位杂交和各种其他技术。 能快速渗透和固定组织。 适合各种不同的组织和不同大小标本的固定。 固定剂易于回收和处理，价格合理。 无毒，无害，无可燃性。,组织固定,固定剂的种类： 1、按照化学性质分类 类：醛类：甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 类：氧化剂类：四氧化锇（奥

3、酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。 类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等 类：其他：氯化汞，苦味酸等 。 2、按照成分分类： 单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等 混合固定液：中性甲醛，AF液等,组织固定,常用的固定方法 蒸汽固定法：甲醛或锇酸可产生蒸汽。用于保存可溶性成分；小而薄的组织，冷冻干燥组织 灌注固定法：肺，肾脏，肝脏等 细胞涂片的固定：浸入法和滴加法，浸入法应注意相互污染的问题 微波固定法：微波加热可缩短固定时间，但时间和温度掌握困难,常用固定液介绍,甲醛（分子式:HCHO）固定: 纯甲醛是一种蒸汽 溶于水后成为37%40%的甲醛溶液（又称福尔马林溶液） 固定液为10%的中性福尔马

4、林（即约含4%W/V的甲醛溶液） 甲醛在水溶液中形成HOCH2OH（亚甲基氢氧化合物）复合物,甲醛（分子式:HCHO）固定: 甲醛的亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多种不同的功能基团结合，使蛋白多肽分子间形成桥键，使蛋白质不再发生改变，保存原位。 -,甲醛（分子式:HCHO）固定的优点: 组织形态结构保存好 固定均匀，穿透性强 组织收缩少 增加组织硬度，便于切片 价格便宜,甲醛（分子式:HCHO）固定的缺点: 封闭抗原决定簇： 醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露，导致免疫组织化学染色产生假阴性。 处理措施： 固定后能够

5、充分水洗，可减少分子间交联。 抗原修复还可使抗原再现。 缩短固定时间(824小时)，降低固定温度(4)可减少交联。,甲醛（分子式:HCHO）固定的缺点: 甲醛内杂质含量多，影响酶染色 含甲酸，固定液酸化，影响染色 产生甲醛颗粒，影响观察，尤以多血的肝，脾组织常见 易挥发，污染环境,10%中性缓冲福尔马林固定液： 100ml40%福尔马林 900ml蒸馏水 NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g 最常用的固定液，抗原保存好，合适免疫组化染色。,常用甲醛固定液,优点： -保存组织中易溶于水的物质，如尿酸结晶和糖原 -常与其他试剂配制成多种混合固定液：加快固定时兼有脱水的作用 缺点： -可溶

6、解脂类物质，要求保留脂类物质时不能使用酒精 -对组织收缩较大，单纯酒精固定组织收缩明显，变硬变脆，制片困难 -渗透力差，组织表面已固定，组织中间固定不佳 -沉淀核蛋白，球蛋白，白蛋白，影响核染色 -价格贵,乙醇（alcohol）固定,醋酸（cetic acid）固定 -对染色质固定较好。 -对脂肪、糖元不能固定。 - 能使组织膨胀，可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故常配成5%混合固定液。 - 穿透速度最快，固定时间短。 - 5醋酸的p值在28，此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性。,-能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂和糖类。 -穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。

7、多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液。 -固定后细胞的结构，特别是核的细微结构显示清晰。 -易产生汞盐的沉着，损害切片刀，因此染色前必须脱汞。,氯化汞（ercury bichloride）,-能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作用。 -穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组织硬化。 -有软化皮肤的作用，配制的Bouin氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好。 -固定时间太久会影响HE染色。 -糖元较好的固定剂。,苦味酸（icric acid）,-可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米以下的组织固定半小时至1小时即可。 -可引起组织较强的收缩使之变硬，对核固定不佳。 -对

8、某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。 -一般多与氯化汞、甲醛混合液使用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。,丙酮,-强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，常配成0.5%水溶液固定组织。 -单独固定组织不能沉淀蛋白质，但加入冰醋酸转变为铬酸，（即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固沉淀。 -与甲醛混合是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂，若配成Eenker氏液，能很好的固定细胞质、胞核及染色体。 -穿透速度快，组织收缩小，固定的组织必须流水充分洗涤（612h），否则影响染色。 对酸性染料染色良好，对碱性料染较差，若加入升汞及醋酸等，则对细胞核染色极佳。,重铬酸

9、钾,乙醇-甲醛液（AF液） 配制：95%或无水乙醇90ml加入40%瓶装甲醛10ml，常用固定液。 兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较好，米粒大小固定46h，大块组织1224h，固定后不经水洗，直接放入95%酒精开始脱水。,enker氏液 配制:重铬酸钾2.5g+升汞5g+蒸馏水100ml，加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液。 用时取此液95ml再加入冰醋酸5ml即成。 enker氏液固定后，细胞核和细胞浆染色较为清晰，特别显示骨骼肌的横纹 固定时间12-24h，然后冲洗24h，切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10），脱碘（5%硫代硫酸钠）流水洗。,Bouin氏液 配制：苦味酸饱

10、和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml 此液渗透快，组织收缩小，固定均匀，为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好，但固定过久对碱性染料的着色有影响。,Garnay氏液 配制：纯酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml 细胞极好的固定液，对淋巴组织及腺体固定很好，米粒大的组织固定12h，也适宜RNA、DNA及糖元的固定。,Helly氏液 配制：重铬酸钾25g+升汞50g+蒸馏水1000ml+甲醛50ml 白细胞颗粒良好的固定剂，可用于造血器官，如骨髓，脾脏的固定。,B5固定液 配制：储备液：氯化汞12g+醋酸钠2.5g+蒸馏水200ml。使用前加2ml甲醛到20ml储备液中 常用于骨髓，淋

11、巴结，脾和其他造血组织的固定。,组织固定注意事项,组织离体后尽早放入固定液中 固定液体的体积应大于标本的45倍，甚至20倍 固定的容器口要方便组织固定后取出 组织固定时间不宜太长，一般不超过72小时，固定不足和固定时间太久都可能影响染色，免疫组化等,组织取材,尸检组织取材 外科切除标本取材 活检小组织取材,组织取材,要求： 取材组织厚度小于3mm，长度和宽度大约2cm为宜。 取材刀锋利，避免组织损伤。 剔除标本中的线头，吻合钉。 有钙化和骨化的组织要脱钙。 保持取材台的干净，流水冲洗。 避免小标本丢失，可用伊红染料标记。 肿瘤标本取材应注意相互关系。 核对标本，以免张冠李戴,组织处理,1、脱水

12、： 将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程称脱水。 脱水是透明前必要的过程。所用试剂为能与透明剂相混溶的试剂。 常用脱水剂有乙醇，正丁醇，丙酮。 脱水过程从低浓度到高浓度，时间一般为20min120min。高浓度乙醇中不能放置太久时间,-尸检及活检：有条件时，将组织分别进行脱水，因为不同组织脱水时间有差异。 -动物组织： 应区分动物大、小，如狗组织接近新生儿组织，大白鼠和小白鼠也有差异，前者需时稍长，后者则较短。 -脱水时间与脱水剂的关系：脱水剂的新旧（纯度）影响脱水时间，必须灵活掌握。 -穿刺组织：如肾穿刺、活检小组织，常规用擦镜纸包裹，涂伊红，以防丢失。,1、脱水时的注意事项：,-非石

13、蜡溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮等，其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。 -脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等组织在脱水后即可直接浸蜡，不经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂。,脱水剂的种类和效果,组织处理,2、透明： 用化学试剂，通常为二甲苯将组织内的脱水剂置换出来的过程称透明。 透明发挥了一个桥梁作用，透明剂可以与包埋剂和脱水剂相溶。 常用透明剂有二甲苯，笨，三氯甲烷等。 一般置换23次透明剂，每次时间1540min。 透明剂易使组织变硬变脆，所以不能让组织在透明剂内放置时间太长。,组织处理,3、浸蜡与包埋： 经过前期处理的标本，再置入支持物中，使支持物渗透入组织，并将组织埋入，包裹的过程。

14、常用支持物有石蜡，树脂，碳蜡，明胶，火棉胶。 一般采用熔点为5658,经三道溶化的石蜡浸渍后,透明剂被全部置换出来。浸蜡温度高于蜡的熔点2 3 。,石蜡：石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为56以上的石蜡。低熔点在54以下，用于酶的显示和保存抗原活性。 石蜡分软蜡（5254），硬蜡（5658），蜂蜡60。一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。 火棉胶： 碳蜡 明胶,浸蜡剂的种类,组织处理,3、浸蜡与包埋： 将蜡液注入包埋的模具中，放好组织后，移至冷台，使组织和蜡液凝固在一起的过程。 包埋应注意组织的埋面，保持组织在一个平面上，间距合适，避免气泡，包埋要迅速，防止组织与蜡分离。,组织处理,手工

15、处理 全封闭柜式自动脱水机（室温） 全封闭柜式自动脱水机（加温） 全封闭柜式自动脱水机（真空负压）,全封闭柜式自动脱水机（樱花tissue-tek VIP6）,常规石蜡切片,多采用轮式切片机，一次性刀片 切片厚度为4um6um 展片水温4248 注意清洁，避免污染 易脱片组织可用防脱片的涂胶载破片 防止切片裂痕，厚薄不均的现象,常规石蜡切片,防脱片的涂胶载破片 多聚赖氨酸：0.1%水溶液，使用时再1:10稀释，涂片 3-氨丙基三已氧基硅烷（APES） 带电荷玻片或阳玻片,冰冻切片,常用于术中快速病理诊断 组织不经脱水，透明等步骤，对蛋白，脂肪，各种酶保存好，合适做组织化学，免疫组化等染色，尤其

16、对不合适石蜡组织的抗体 组织会膨胀，细胞变大，出现与常规切片的一些差异,常规HE染色,染色的意义和目的： 用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。,常规HE染色,HE是苏木素（haematoxylin）和伊红（eosin）的缩写 苏木素是从苏木素树的树心中提炼的天然碱性染料，苏木素经过氧化后变成苏木红，在媒染剂作用下形成蓝色色精，对细胞核具有良好的染色能力 伊红属酸性染料，化学名称四溴荧光素二钠，分为水溶性和醇溶性两种，常规HE使用的是水溶性伊红,常规HE染色染色的原理,细胞核染色的原理：细胞核主要是DNA，带负电荷，呈酸性，容易与带正电荷的碱性染料结合，苏木素氧化呈苏木红，苏木红与媒染剂中金属阳离子结合形成蓝色色精，以离子键或氢键与核结合。 细胞质的染色的原理：细胞质主要是蛋白质，为两性化合物，等电点为pH4.75