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1、葡萄糖酸的发酵生产,生工本0901 寇凤雨,葡萄糖酸的性质,葡萄糖酸是葡萄糖衍生的糖酸,分子式为C6H12O7。为结晶状化合物，熔点131,呈弱酸性，溶于水，微溶于乙醇。在水溶液中转化为-葡萄糖酸内酯和 葡萄糖酸内酯的平衡混合物。,葡萄糖酸作为蓬松剂、凝固剂、鳌合剂、酸味剂而广泛应用于食品、医药、建筑等行业，葡萄糖酸与钠、钙、锌、亚铁等金属氧化物合成制得的葡萄糖酸盐可作为食品添加剂和营养增补剂添加到食品中。葡萄糖酸的金属络合物在碱性体系中广泛用作金属离子的掩蔽剂。 葡萄糖酸钠可分为工业级，食品级和医药级目前我国市场价格分别在4300-4800 /t，7800-8500元t，8800-10000
2、元t。,山东凯翔生物化工有限公司专业从事葡萄糖酸钠，葡萄糖酸内酯，衣康酸的研究、开发、生产和销售，拥有先进的生物发酵设备、一流的检测手段、现代化的科学管理级雄厚的技术力量，并通过了ISO9001国际质量管理体系认证、ISO14001国际环境管理体系认证、OHSAS18001国际职业健康安全管理体系认证。 公司年产葡萄糖酸钠35000吨，是国内最大的生产供应商，生产的“凯翔”牌葡萄糖酸钠，葡萄糖酸内酯各项技术指标均达到国际先进水平，产品畅销美洲、欧洲、东南亚、中东等国家和地区。,上海卡博工贸有限公司 山东新华医药集团 山东中舜科技发展有限公司,葡萄糖酸的发现,1880年Boutroux发现使用醋
3、化醋杆菌发酵葡萄糖能够产生一种不挥发的酸，后来确定为葡萄糖酸。 以后的许多研究者报道了其他几种细菌也能够产生葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸。上个世纪30年代以前，生产葡萄糖酸主要是使用细菌。1922年，Molliard发现，利用霉菌也能够发酵葡萄糖酸，后来人们知道黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有氧化葡萄糖产生葡萄糖酸的能力。,葡糖糖酸工艺的发展,Bernhager在1924年发现，采用中和生成酸的方法，黑曲霉能够高效地将葡萄糖转化为葡萄糖酸，而添加碳酸钙是最好的。在较低温度，限制氮源的条件下，生成的葡萄糖酸几乎可以达到理论产率。,1952年，Blom等发明了添加NaOH、维持pH65以上的方法生产葡
4、萄糖酸钠，使糖的转化率达95以上，发酵时间缩短至20小时以内，这种工艺形成了现代工业深层发酵的基础。,1999 年,黄道震等以葡萄糖含量为30 %的发酵培养基接种10 %的黑曲霉种子液,通气、220 r min - 1，搅拌、流加氢氧化钠溶液控制p H 值6.06.5 、温度32 34 、发酵20 h , 残糖可降至1 g L - 1 以下。 2002 年,Anastassiadis 等利用筛选得到的短梗霉( Aureobasi di um p ul l ul ans) 在连续式搅拌发酵罐中进行了静息细胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实验,葡萄糖酸浓度可达260 g L - 1 ,最高生成速率
5、为19 gL - 1.h - 1 。,葡萄糖酸发酵的生物工艺,黑曲霉发酵能力的特性不仅由其遗传特性决定，其所处的环境条件也决定了发酵法生产葡萄糖酸的产量，发酵法生产葡萄糖酸产量的高低除了受生产菌种的影响外，培养基的组成和培养条件对产量的影响也很大。黑曲霉发酵水平的提高，主要依赖于菌种选育及发酵工艺(培养基和培养条件)的优化，这两个环节是相辅相成的。,菌种选育按照生产要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水平的目的；而发酵工艺的优化是改变培养基的在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅拌转速、调节pH等措施，从而强化微生物的生物合成的全过程
6、，提高发酵产量。通过工艺优化，改进发酵培养基成份和发酵条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，从而显著提高发酵产量,高产菌株的筛选,紫外线诱变取黑曲霉P-9的孢子，用无菌生理盐水制成108个/mL的孢子悬液。取 2mL孢子悬液于无菌培养皿中，铺成一层薄层，于暗室内30w紫外灯下20cm处照射8min。取照射液进行适当稀释，涂布于选择培养基，用黑纸包裹，30恒温避光培养4d，待长出孢子后，将孢子点种于筛选培养基，挑选在菌落周围出现较大蓝色圈的菌株，分别进行发酵并测定葡萄糖氧化酶活力。,葡萄糖氧化酶酶活力的测定 本研究采用分光光度计分析法测定葡萄糖氧化酶活性。反应混合液
7、含2mL1mol/L 葡萄糖（0.1mol/L的柠檬酸钠-磷酸缓冲液配制，PH=5.0)，1mL 0.1苯醌和100uL 粗酶液，反应液于35 下保温反应10min，于290nm 处测定形成的氢醌的量。葡萄糖氧化酶的单位（U）定义为35 PH=5.0 下每克菌体每分钟产生1umol氢醌的酶量。,蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄糖氧化酶将培养基中 的葡萄糖转化为葡萄糖酸，葡萄糖酸与KI反应将I- 离子还原为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉反应形成蓝色化合物而使菌落周围出现蓝色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶的产量成正相关。该方法可以作为葡萄糖氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大大提高葡萄糖氧化酶产生菌的
8、诱变育种效率。,葡萄糖氧化酶产生菌的诱变选育 黑曲霉P-9 经过紫外线照射处理，共获得8 个耐受2-脱氧-D-葡萄糖的突变菌株，分别是U-15、U-17 、U-56、U-69、U-78。5个耐2- 脱氧-D- 葡萄糖突变株经蓝圈筛选和发酵测定，有3个菌株的葡萄糖氧化酶产量高于出发菌株，产酶水平最高的是U-69 菌株，为是28.7U/g出发菌株P-9倍，结果见表1。,表1 经过紫外线诱变所获得的突变菌株的葡萄糖氧化酶活性,葡萄糖酸发酵生产 一 材料和仪器 1 菌种 黑曲霉 （U-69 菌株） 2 培养基 (1) 查氏培养基( g L - 1 ) : 蔗糖30 ,NaNO3 4 g, MgSO4
9、7H2O 0.5g,KCl 0.5g ; FeSO4 0.1 g,K2 HPO4 1 g, 琼脂20 g,p H 值5.5 ,温度31 。 (2) 种子培养基(g L - 1 ) :葡萄糖(水解糖) 40 ,麸 皮32 , ( N H4 ) 2 HPO4 0.4 g, KH2 PO4 0.2 g, MgSO4 7H2O 0.2g ,CaCO3 10 g,p H 值5.6 。 (3) 发酵培养基(g L - 1 ) :葡萄糖(水解糖) 100 300 , ( N H4 ) 2 HPO4 014 , KH2 PO4 012 , MgSO4 7H2O 0.15 g,CaCO3 2781 ,p H 值
10、5.6 。,主要仪器 SHZ-82 型恒温振荡器 SKP-201B 型电热恒温箱 SBA-240C 型生物传感分析仪 FLC-23 型超净工作台 722S 型可见分光光度计 TD52-2 型自动平衡离心机 10 L 发酵罐,培养方法 种子培养 250 mL 三角瓶中装液量为30 mL ,接种后置于 30 、220 r min - 1摇床培养1820 h 。 摇瓶发酵培养 取孢子悬液接入发酵培养基中(250 mL 三角瓶中 装液量为30 mL) 置于33 、250 r min - 1 摇床 培养,发酵结束后测残糖及葡萄糖酸的浓度。 发酵罐发酵 10 L 发酵罐装料7 L ,接种10 %的黑曲霉种
11、子悬 液,搅拌转速250 r min - 1 ,无菌空气流量 0.4m3 h - 1 ,维持温度33 ,流加30 %的碱液维持pH5.6 。残糖含量降至015 %以下时,结束发酵。,发酵过程影响葡萄糖酸产量的因素,葡萄糖浓度 发酵液PH值 溶氧 接种量,葡萄糖酸浓度的测定 发酵过程中葡萄糖酸的生成会导致发酵液p H 值下降,利用NaOH 与葡萄糖酸中来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钠盐,其葡萄糖酸根可与Cu2 + 、Fe3 + 等金属离子发生络合反应,加热后呈现一定的色,660 nm 波长下可测定其吸收值,由标准曲线方程推算可知葡萄糖酸的浓度。,EDTA 定钙法，发酵过程中葡萄糖酸的生成
12、导 致发酵液p H 值下降,利用Ca (O H) 2 及CaCO3 与葡萄糖酸中和来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钙盐,通过直接测定发酵液中钙离子的含量可折算得到生成的葡萄糖酸浓度(W G) 。 cE V E M W G = - V S 式中: cE 为所用EDTA 的浓度,mol L - 1 ;M 为葡萄糖酸的摩尔质量,196 g mol - 1 ;V E 为所用EDTA 的体积,mL ;V S 为所取用的待标定溶液的体积,mL 。,葡萄糖含量的控制方式 葡萄糖在较高含量下,对许多微生物的生长和代谢都有抑制作用,使菌体生长速率和产物生成速率处于较低水平,发酵时间大大延长。 摇瓶实验 在
13、葡萄糖含量分别为10 %、20 %和30 %的发酵培养基中分别添加27 g L - 1 、54 g L - 1 、81 g L - 1CaCO3 ,摇瓶发酵30 h ,考察葡萄糖含量对黑曲霉产酸的影响,结果见表2,表2 葡萄糖含量对摇瓶发酵产酸的影响,由表1 可见,随着葡萄糖含量的增加,葡萄糖平均消耗速率加快,这说明高含量的葡萄糖对黑曲霉的生成和代谢没有抑制作用。从发酵糖酸转化率和葡萄糖酸平均生成速率上来看,糖含量为20 %时最高。若采用30 %葡萄糖摇瓶,培养基中葡萄糖浓度和CaCO3 浓度太高,培养基粘度太大,严重阻碍了氧的溶解与传递,副产物生成量增加,导致转化率和葡萄糖酸平均生成速率下降
14、。为此,可以采取初糖含量为20 %、分批流加葡萄糖至30 %和分批添加CaCO3 至总量81 g L - 1 的方法来进行发酵工艺控制。,pH值的控制方式 黑曲霉在葡萄糖酸的生成过程中p H 值会不断下降,若降至415 以下会导致柠檬酸的生成,为此需对发酵过程中p H 值进行控制,一般可通过添加碳酸盐、金属氧化物和碱来实行。在10 L 发酵罐(装液量615 L ,葡萄糖含量20 %) 中分别采用NaO H、Ca (OH) 2 、CaCO3 来控制p H 值,考察了不同控制方式对黑曲霉 发酵产酸的影响,结果见表3 。,表3 10 L 发酵罐中pH值控制方式对发酵产 葡萄糖酸的影响,由表2 可见,
15、发酵过程中流加NaOH 控制p H值,各项指标都达最高,发酵时间最短;流加Ca (OH) 2乳浊液和添加CaCO3 控制p H 值的指标接近,但比流加NaOH 要低很多。当临近终点时,发酵液出现大量白色的葡萄糖酸钙结晶颗粒,使得发酵产物的浓度受到限制,无法得到高浓度葡萄糖酸。,比较3 种pH值控制方式,若是要生产葡萄糖酸钠,应采取流加NaOH来控制pH值,发酵时间短,p H值控制精确,产物含量可达20 %以上;若是生产葡萄糖酸或其它盐类最好采取流加Ca(OH)2乳浊液或添加CaCO3 来控制,虽然发酵时间长、产物浓度受到限制,但后处理阶段因钙离子可与硫酸生成硫酸钙沉淀,减轻了阳离子交换负荷,产品纯度也高,但添加CaCO3 来控制pH值时,pH值控制范围受CaCO3 质量的影响,一般来说,轻质CaCO3可将pH值控制5.05.5 之间。,溶氧的变化与控制方式 10 L 发酵罐中溶氧与葡萄糖酸的动态变化曲线见图2 。,由图2 可见,发酵开始后,溶氧含量一直下降,第8 h 达到最低点,而后逐步升高;葡萄糖酸浓度自发酵开始后就一直上升,但04 h 和1434 h 这两段曲线斜率较大,葡萄糖酸生成速度较快,414 h 曲线的斜率较小,并恰好与溶氧曲线上溶氧含量40 %以下的阶段相一
