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1、,第六章 植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产,1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。,北京锦绣大地农业股份有限公司 植物次生代谢产物概述 2 细胞的初代培养 3 高产细胞系的筛选 4 植物细胞悬浮培养方法 5 植物次生代谢物质生产,1.1 植物代谢产物 （1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。 （2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。,
2、类别 次生代谢产物 用途 黄酮 银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病 醌 紫草宁 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 简单酚类 香豆素 香料，抗菌消炎 萜 类 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗疟疾 生 物 碱 长春新碱 抗癌 奎宁 抗疟疾,酚类化合物,长春碱： 2 million/kg 长春新碱： 15million/kg,李时珍在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。 次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、工业原料等。,紫杉醇：二萜类化合物 最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的
3、树皮中分离 广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症 目前主要来源于红豆杉属植物,紫杉醇简介,市场需求,抗癌一线用药 销售额年增长率5亿美元 理论需求量 2g /人, 500万人/年 1000kg/年 实际销量 350 kg/年,紫杉醇供需相差十分悬殊,图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）,图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）,药源问题,红豆杉 主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种之一 生长缓慢 分布有限 Taxol含量低 树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人,700岁的红豆杉惨遭剥皮,人
4、工栽培 采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗 寻找红豆衫的替代物 从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物,药源问题解决办法（一）,药源问题解决办法（二）,化学合成 全合成 1994年获得成功 现有六种途径 半合成 以10-DAB和Baccatin 作为半合成原料获得紫杉醇,药源问题解决办法（三）,生物方法 组织和细胞培养 微生物发酵 生物合成 研究阶段 红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量,1.2 获得植物次生代谢产物的方法,植物细胞具有形态全能性，化学全能性 （在离体的条件下可以合成整株植物能合成的
5、物质）,自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较 生产方式 生产周期 紫草宁含量（干重） 完整植物 23年 12 植物细胞培养 3周 14,细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径： 缩短周期，提高生产效率 植物细胞培养生产周期为15-30d；而完整植株生长短则几个月，长则数年，如木瓜8个月，而紫草为5年 易于管理，减轻劳动强度 培养在无菌条件下进行，可排除病虫害干扰 可探索新的合成路线，获得新的有用物质,1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小的细胞团在液体培养基中进行大规模培养的技术。,次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率,可控,遗传因素决定,植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、
6、易聚团等特点。 植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。 适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。,2 细胞的初始培养 实验中获得适宜于悬浮培养的细胞系的过程称为细胞的初始培养。 2.1建立悬浮系,获取悬浮培养的细胞,细胞的振荡培养,酶解法,愈伤组织培养法,使细胞团分散,促进气体交换,搅拌培养； 旋转振荡培养； 旋转培养,培养方式：,2.2 建立良好的悬浮系的关键环节 1. 选择适宜的外植体 双子叶植物：幼胚、成熟胚、下胚轴、叶片 单子叶植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花药等,2. 诱导疏松愈伤组织； 培养基 愈伤组织的异质性
7、； 继代培养 3. 选择适宜的培养基； 基本培养基+CTK/AUX+天然复合物 eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE 培养基的PH,李忠光，龚明. 2006.7,4. 悬浮培养初期的控制 转速，光，温度 5. 悬浮细胞的继代与选择 继代中收集小的细胞团 条件培养基：新鲜培养基,3 高产细胞系的筛选(P113) 3.1高产细胞系 筛选的整体思路,外植体,愈伤组织的诱导筛选,悬浮培养细胞,高产细胞系筛选,高产细胞系的建立 高产细胞株系的特点 培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物 细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物 代谢产物要在细胞中积累，而不被
8、迅速分解，最好能将其释放到培养基中,高产细胞系的筛选过程 选定特定起始材料 准确选择能够产生目的代谢产物的植物种类、品种或单株 应尽量选择自然状态下产生天然产物的组织或器官为外植体 诱导愈伤组织，并获得单细胞悬浮液 诱变处理细胞悬浮液，筛选目的突变细胞 通过单细胞培养突变细胞，获得突变细胞无性系（即突变细胞愈伤组织获得）,高产细胞系的筛选方法 目测法 注意：真正的变异体or生理状态不同的细胞克隆 根据单细胞克隆次生代谢产物含量进行筛选 抗性筛选 如：添加抗性抑制剂 庚二酸-生物素 诱变筛选,3.2 高产系的稳定性及保存方法 尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保存法（0-4），超低温保存法（
9、-196 ）保存。 同时从高产系中不断克隆形成新的高产细胞系。,4 植物细胞悬浮培养的方法 悬浮培养：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中，不断搅拌或者振荡培养，使细胞快速、大量增殖。 技术难点： 通气、剪切力的适应性；细胞同步化控制。 培养：培养基：基本培养基+CTK/AUX 培养条件：温度、氧气、PH、转速 同步化控制 细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。,4.1 细胞悬浮培养的方法(P117) 分批培养法 连续培养法 半连续培养法 细胞固定化培养,分批培养：把细胞分散在一定溶积的培养基中进行培养。 注：中途不添加也不更换培养基,设备简单，操作方便，重复性好。
10、 适合与突变体筛选和遗传转化的研究。,悬浮培养细胞增殖曲线,（1）细胞扩增生长成S形曲线 （2）继代培养：要求缩短滞后期 滞后期的长短：a 继代细胞所处的生长时期；对数期 b 继代的细胞密度 104-105个/ml,连续培养：在培养过程中，不断向反应 器中以一定流量添加新培养基，同时以 一定流量从系统中取出培养基及培养物的方式。,半连续培养：在完成分批培养的一个周期 后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只 保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的 种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养 的方式。 细胞固定化培养：将细胞固定在固相基质上，放入培养液进行培养的方式。,悬浮培养反应器的类型： 机械搅拌式反应
11、器 气动式反应器,内循环气升式,外循环气升式,机械搅拌式,内循环气升式,外循环气升式,4.2 培养基：与培养的细胞密度相关 （1）高密度悬浮系（5*104个/ml） a 用B5，ER等专用培养基 b 对传统培养基做出改良 如：加大2,4-D用量；改良MS，加入VB、CH等天然复合物 （2）低密度悬浮系（5*104个/ml） a 条件培养基 b 向培养基中添加多种成分，尽可能满足细胞生长的需要,细胞同步化：同一悬浮培养体系的大多数细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 细胞培养的同步化方法： 饥饿法：限制必需物质的供应 抑制法：化学抑制，物理抑制 分级培养：细胞分级仪,4.3 悬浮细胞培养的同步
12、化(P121),4.4 悬浮细胞的生长量和活力分析(P122) （1）测定悬浮细胞数量的方法： 细胞计数-血球计数板 鲜重、干重的测定 细胞密实体积(PVC) （2）细胞活力测定 二乙酸荧光素法 （FDA）-活细胞内有荧光产生 伊凡兰染色法-染色受损细胞核-死细胞 相差显微镜法-胞质环流是否存在,5 植物细胞大规模培养生产次生代谢物质 植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。 从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件： 1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。 2、细胞
13、生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。 3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。,5.1 技术路线 (1) 选择适宜的外植体；诱导疏松愈伤组织； (2) 通过含量分析，选择高产细胞系 (3) 研究培养条件（达到高产、稳产）； (4) 建立悬浮细胞培养、优化培养条件 （达到高产、稳产）； (5) 小试、中试、优化培养条件； (6) 大规模培养； (7) 工业化生产，产品分离，纯化。,5.2 提高次生代谢产物产量的方法 （1）筛选高产细胞系 不同植物种类，不同植株及同一植株的不同部位，往往有不同的代谢能力； 通过人工诱变改良细胞系； 通过遗传改良
14、筛选细胞系。,云南红豆杉,东北红豆杉,中国红豆杉,南方红豆杉,杂种红豆杉,筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需要定期检测，更新细胞株系。,培养基的营养成分一方面要满足植物细胞的生物量增长，另一方面要使细胞能合成和积累次生产物。故在生长的第一阶段使用生长培养基；第二阶段使用生产培养基,一般来说增加培养基的N、P和K浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成；而激素需根据实验确定,适于植物细胞悬浮培养的基础培养基主要是B5和ER,（2）优化培养基 基本培养基+激素+天然复合物,（3）改善培养条件 对于任何一种细胞培养
15、，培养条件都要通过多次的试验摸索确定。 eg: 在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。,（4）培养基中添加前体物质,在细胞内次生代谢物质是以初生代谢物质为原料，经过一系列的化学转化而合成的，因此，每种次生代谢产物都有一条生物合成途径。 前体物质：次生代谢物质生物合成途径的中间体物质,烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。,第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）； 第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。,（5）二步培养法,（6） 使用诱导子 诱导子是能刺激细胞合成次生产物的物质 A 生物诱导子：微生物菌丝、提取物、多糖、蛋白质类等；植物细胞碎片、寡聚糖等 B 非生物诱导子：辐射、金属离子,
