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1、Western Blot基本原理及操作 中山医院临床医学研究院 侯嘉云 hou.jiayunzs- Michael A. Milhollen, cancer research, 2011 流程流程 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白提取蛋白提取 蛋白定量蛋白定量 蛋白定量蛋白定量 简介 以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 简介 以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 样品准备样品准备 样品制备过程中的一些要点与建议样品制备过程中的一些要
2、点与建议 收集细胞离心时转速需适当； 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子； 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白 修饰的改变，制备过程应在低温进行； 样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直 接以液体状态置 -80中保存，但要注意不要反 复冻； 煮样时防止爆管 分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶制备凝胶制备-分离胶分离胶 灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 浓缩胶浓缩胶( (5%) ) 凝胶制备凝胶制备-积层胶积层胶 灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子 制备凝胶中的要点制备凝胶中的要点 AP要新鲜配制； 混合搅拌速度太快
3、易产生气泡影响聚合， 导致电泳带畸 形，太慢不均匀； 分离胶勿倒的过满，需留一定的空间； 凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬， 从而电泳时易烧胶 保持所有装置清洁； 试剂要有正确的pH值，及妥当的保存 凝胶电泳凝胶电泳 Staking gel Separating gel 小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥； 浓缩胶 80v左右，分离胶100v左右 上样的注意要： 20-50ug总蛋白 或100ng纯蛋白， 可根据蛋白 表达水 平进行优化； 尽量保持每个泳 道的蛋白量一样， 体积尽量一致； 样品两侧的及空 置的泳道用等体积 的1loading buffer上样 以医院lo
4、go颜色为整体色系，总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 转膜转膜 转膜转膜 转膜转膜 转膜转膜 转膜转膜 转膜中的要点与建议转膜中的要点与建议 封闭封闭 抗体孵育抗体孵育 抗体孵育抗体孵育 直接法与间接法的比较直接法与间接法的比较 直接法直接法 间接法间接法 快速（一种抗体） 额外的二抗孵育以及条件优化 没有二抗交叉反应引起的非特 异性条带 交叉反应引起的非特异性条带 无信号二级放大 信号放大灵敏度高（多个二抗 结合位点） 免疫反应性降低 免疫特异性不受标记影响 对照对照 内参的选择内参的选择 目的蛋白分子量 相差5KD以上 实际的试验环境 组织缺氧、糖尿病： GAPDH升高 凋亡及移除核
5、膜： Lamin 骨骼肌：beta-actin 检测方法检测方法 常见问题常见问题-信号弱或无信号信号弱或无信号 常见问题常见问题-高背景高背景 常见问题常见问题-条带位置不对或有非特性条带条带位置不对或有非特性条带 常见问题常见问题-块状染色块状染色 常见问题常见问题-弥散弥散 常见问题常见问题-条带弯曲条带弯曲 常见问题常见问题-其他其他 安全注意事项安全注意事项 原则 操作有毒试剂，带口罩和手套 操作挥发性试剂应在通风橱中进行 安全注意事项安全注意事项 PMSF：苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂，它对呼吸道黏膜、眼 睛和皮肤有非常大的破坏性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而致命 T
6、riton X-100：引起严重的眼睛刺激和灼伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害 SDS (十二烷基硫酸钠)：有毒，是一种刺激物，并造成对眼睛的严重损伤的危险 DTT （二硫苏糖醇）：很强的还原剂，散发难闻的气味，可因吸入、咽下或皮肤吸 收而危害健康，由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差 Acr（丙烯酰胺）：具有很强的神经毒性，同时还有生殖、发育毒性，可能具有致 癌性，可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体，其作用具有积累性。聚丙烯酰胺无毒， 但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分 Bis （甲叉双丙烯酰胺）：有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末 AP(过硫酸铵)：对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命 TEMED：强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封 NaN3 (叠氮钠)：毒性非常大，阻断细胞色素电子运送系统 谢谢！谢谢！
