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1、实验26 植物细胞膜脂过氧化产物MDA含量的测定一、目的植物器官衰老或在逆境下遭受伤害时，往往发生膜脂过氧化作用。膜脂过氧化作用的产物比较复杂，包括一些醛类、烃类等。其产物之一丙二醛(MDA) 从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，研究中常以MDA含量来反映植物膜脂过氧化的水平和对细胞膜的伤害程度。通过本实验，使学生加深对细胞膜脂过氧化作用的认识，掌握丙二醛测定的原理与技术。 二、原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA
2、)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDATBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克干重100300gg1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终
3、浓度为05molL-1。 1直线回归法 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖(025mmolL1)与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y5320.001980.088D450 （8.31） 2双组分分光光度计法 据朗伯一比尔定律：DkCL，当液层厚度为1cm时，kDC，k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消
4、光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度值之和。 已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40和7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式： C111.71D450 （8.32） C26.45（D532D600）0.56D450 （8.33）式中 C1：可溶性糖的浓度(mmolL1)； C2：MDA的浓度(molL1)； D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。 三、主要仪器设备 紫外可见分光光
5、度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：l0ml 1支，2m11支；剪刀1把。 四、实验步骤（一）试剂准备 10三氯乙酸(TCA)； 0.6硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1molL1)溶解，再用10的三氯乙酸定容； 石英砂。 （二）实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。 （三）MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2m110TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000rmin-1离心10min，上清液为样品提取液。 (四)显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入
6、2ml 0.6TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。 五、结果计算 （一）直线方程法 按公式8.31求出样品中糖分在532nm处的消光度值Y532，用实测532nm的消光度值减去600nm非特异吸收的消光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532mn处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。 （二）双组分分光光度法 按公式8.33可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。 用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量： MDA含量(mol g-1)=MDA浓度(molL-1)提取液体积(ml)植物组织鲜重(g) 六、注意事项 TBA试剂最好现配现用。
