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1、1耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药相关基因的研究作者：颜英俊 刘华 杨明清 黄文方【摘要】 目的 分析我院 2005 年 112 月临床分离 34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药相关基因存在状况，为临床抗感染治疗提供依据。方法 应用 PCR 方法检测 13 种 内酰胺类抗菌药物耐药相关基因，分别为blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaOXA10 、blaPER、blaVEB、blaGES、blaDHA、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM、oprD2；3 种氨基糖苷类修饰酶基因，分别为：aac(6)I 、aac(6)II 和 ant(2)I ；整合酶基因 I(
2、intI1)。结果 耐药相关基因 blaTEM、blaCARB、blaDHA、blaIMP、oprD2、aac(6)I 、aac(6)II 和 ant(2)I 、intI1 阳性率分别为：5.9%、32.4%、14.7%、17.6%、97.1%、21.2%、33.3%、48.5%、3.0%；其余耐药基因均未检测到。结论 携带多种耐药相关基因是耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对多种抗生素耐药的重要原因之一，膜孔蛋白基因 oprD2 缺失不是本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。 【关键词】 铜绿假单胞菌； 亚胺培南； 内酰胺酶类； 氨基糖苷类修饰酶； 整合酶 I； 耐药基因ABSTRACT Obje
3、ctive To investigate 34 strains of the antimicrobial resistance related genes of imipenemresistant Pseudomonas aeruginosa from patients from Jan to Dec 2005. Method Antimicrobialresistance related genes were detected by PCR method, including blaTEM, blaSHV, blaCARB, blaOXA10, blaPER, blaVEB, blaGES,
4、 blaDHA, blaIMP, blaVIM, blaGIM, blaSPM, oprD2, acc(6)I, aac(6)II, ant(2)I and intI1. Results The positive rate of antibiotics resistant related genes, named blaTEM, blaCARB, blaDHA, blaIMP, oprD2, acc(6)I, aac(6)II, ant(2)I and intI1 were 5.9%, 32.4%, 14.7%, 17.6%, 97.1%, 21.2%, 33.3%, 48.5% and 3.
5、0%, respectively. While blaSHV, blaOXA10, blaPER, blaVEB, blaGES, blaVIM, blaGIM and blaSPM genes were not detected. Conclusion The tested strains which carried multiple resistant genes related to imipenem were one of the main cause of the Pseudomonas aeruginosa resistant to many antibotics, while v
6、oid of oprD2 gene was not necessaryly the main cause of bacteria resistant to imipenem.KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; Imipenem; lactamases; Aminoglycoside modifying enzymes; Integion I; Resistant genes铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)为条件致病菌，广泛分布于自然界及健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下不感染人体任何组织，但当机体免疫力降低时、严重创伤或医疗
7、操作后，Pa 几乎可以感染人体任何组织。2临床表现为局部化脓性炎症和全身性感染，常常危及患者的生命。近年来，由于抗生素泛用和滥用，耐药和多重耐药 Pa 呈上升趋势。亚胺培南为碳青霉烯类药物，是一种新型的 内酰胺类抗生素，被认为是目前控制某些革兰阴性菌临床感染性疾病最有效的药物之一，但随着广泛使用和过度使用，Pa 耐药性也逐渐增加。本文应用分子生物学方法研究我院 Pa 对常用抗菌药物耐药相关基因的类型和分布流行特点，为临床治疗提供依据。1 材料与方法1.1 菌株来源与质控菌株34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa)来自于 2005 年 112 月我院住院患者的临床分离标本(包括痰液、尿液、
8、伤口分泌物、脓液和血液等)。质控菌株为铜绿假单胞菌 ATCC27853 和大肠埃希菌 ATCC25922。1.2 菌株鉴定及药敏试验方法所有菌株均以 BD Phoeni100 全自动微生物分析仪鉴定到种，药敏试验采用 BD Phoeni100 配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、四环素和复方磺胺甲口恶唑共 16 种抗生素，头孢哌酮/舒巴坦采用 KB 法。药敏标准按 2005 年版CLSI M100S15 规定执行。1.3 主要仪器设备与试剂Eppend
9、orf centrifuge 5417R 低温离心机，恒温金属浴(杭州大和公司)，MJ Peltier Thermal Cycler(美国 MJ Research 公司)，BioRAD 电泳仪，BioRAD 凝胶成像系统，琼脂糖(Oxoid 公司)，100bp DNA Ladder Marker(大连宝生物公司)，6上样缓冲液(北京天为时代)。1.4 模板 DNA 提取采用蛋白酶 K 消化法。1.5 基因扩增应用 PCR 方法共检测 17 种耐药相关基因，引物序列见 Tab.1。氨基糖苷类基因 aac(6)I 、aac(6)II 、ant(2)I 和整合酶基因 intI1 热循环参数为：93预
10、变性 2min93 30s55 30s72 60s，共 35 个循环，最后72延伸 2min。 内酰胺类耐药相关基因 blaDHA 和 oprD2 热循环参数为：93预变性 3min9330s5530s7260s， 共 35 个循环， 最后 72延伸 5min。其余基因热循环参数为：93预变性 3min93 60s55 60s72 60s，共 35 个循环，最后 72延伸 5min。纯水为阴性对照。耐药基3因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。1.6 结果判断取 10l 扩增产物与 2l6上样缓冲液混匀，点样于 1.5%琼脂糖凝胶，100V 电压电泳 30min，出现目的条带即为检测基因
11、阳性。2 结果2.1 IMPRPa 的耐药特点IMPRPa 除对阿米卡星 100%敏感，对哌拉西林和哌拉西林/三唑巴坦较敏感，敏感率分别为 48.39%和 55.84%，对其余 内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素、磺胺类抗生素耐药严重，结果见 Tab.2。2.2 耐药基因检测结果本组试验 IMPRPa 中，17 种耐药相关基因检测结果和部分琼脂糖电泳结果分别见 Tab.3 和 Fig.1Fig.5。3 讨论近十多年来，由于广谱头孢菌素及碳青霉烯类药物的广泛应用，细菌耐药率有增长趋势，特别是多重耐药和耐 IMP 的 Pa 是临床抗感染治疗的难点之一，备受国内外学者关注。我院 2005 年 112 月分
12、离的 34 株 IMPRPa 除对阿米卡星敏感(敏感率 100%)外，哌拉西林和哌拉西林/三唑巴坦对 Pa 有较强的抗菌活性，敏感率分别为 48.39%和 54.84%，第三代、第四代头孢菌素及氨曲南、喹诺酮类等抗生素抗菌活性差，敏感率为 3%30%。有 29.03%的 IMPRPa 对美罗培南敏感，提示 Pa 对亚胺培南和美罗培南的耐药机制不尽相同。34 株菌对氯霉素、复方磺胺甲口恶唑和四环素全部耐药，因此应重视和加强细菌耐药监测，合理应用和优先选用低耐药可能性的抗生素，将有助于控制细菌耐药，避免 IMPRPa 引起医院感染流行1 。 细菌产生 内酰胺酶是细菌对 内酰胺类抗生素耐药的最重要机
13、制之一，由于 Pa 具有比较特殊的细胞壁和细胞膜结构，对许多 内酰胺类抗生素存在固有耐药，临床多采用羧基及酰胺类青霉素、第三代头孢菌素和碳青霉烯类 内酰胺类抗生素治疗 Pa 感染。但随着 内酰胺类抗生素的过度使用和泛用，耐 内酰胺类抗生素的 Pa 不断增加，已成为临床抗感染治疗的棘手问题。近年来，国内外学者已从 Pa 临床分离株中检测到多种 内酰胺酶和碳青霉烯酶基因。本组实验菌株携带 blaTEM、blaCARB、blaDHA 和 blaIMP耐药基因的阳性率分别为 5.9%、32.4%、14.7%和 17.6%，可见携带多种 内酰胺酶基因是本组细菌对 内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。Opr
14、D 分为 D1 和 D2，研究发现与亚胺培南耐药有关的为 OprD2，铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprD2 孔道是小分子亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，也允许带有阳性电子基团的各种糖类及碱性氨基酸非特异扩散。OprD2 蛋白是目4前所知的 Pa 外膜中唯一有助于抗生素通透的孔道蛋白，具有配体特异性，不仅能形成亚胺培南的特异结合位点，同时发现碱性氨基酸为亚胺培南的竞争性抑制剂。其它 内酰胺类抗生素均不能通过 OprD2 通道，所以碳青霉烯类抗生素与其它 内酰胺类抗生素无交叉耐药性2 。一般认为 OprD2 缺失是 Pa 对IMP 耐药的主要机制35 ，但国内相关报道差别较大，比如：温州地区报
15、道89.3%(25/28)oprD2 基因缺失3 ，江苏无锡报道 68.8%(11/16)oprD2 基因缺失6 ，湖北襄樊报道 100% oprD2 基因缺失(35 株)5 ，浙江绍兴报道研究的 5株 IMPRPa 均无 oprD2 基因缺失7 。本研究 oprD2 基因缺失占 2.9%，提示oprD2 基因缺失不是本组 IMPRPa 耐药的主要原因，但不排除因 oprD2 基因突变或基因表达下调导致 Pa 对 IMP 耐药，后续研究正在进行中。氨基糖苷类修饰酶(AMEs)可分为三类8：乙酰转移酶，由 aac 基因家族编码；核酸转移酶，由 aph 基因家族编码；核苷转移酶，由 ant 基因家
16、族编码。革兰阴性杆菌以 aac(6)I 、aac(6)II 、ant(2)I 和 ant(3)I 等基因常见。AMEs 基因多位于整合子上，传播迅速。本组试验菌株中 ant(2)I 携带率较高，为 48.5%，其次为 aac(6)II 和 aac(6)I ，携带率为 33.3%和21.2%。试验结果提示本组试验菌株编码产生 AMEs 是对庆大霉素耐药的重要原因之一。34 株 IMPRPa 全部对阿米卡星敏感(敏感率 100%)，可能是阿米卡星对 Pa产生的氨基糖苷类钝化酶较稳定。过去人们对细菌耐药性的研究主要集中在细菌染色体基因突变，后来发现获得性耐药基因才是大多数细菌产生耐药性的原因。1989 年 Stoke 等9首次提出了一个
