链霉菌实验操作手册

《链霉菌实验操作手册》由会员分享，可在线阅读，更多相关《链霉菌实验操作手册（27页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1 链霉菌室实验操作手册（链霉菌室实验操作手册（2003200320032003 年）年） 第一章第一章培养基培养基 抗生素抗生素 生长因子生长因子 3 3 3 3 常用抗生素及其使用浓度常用抗生素及其使用浓度.3 LBLBLBLB（Luria-BertaniLuria-BertaniLuria-BertaniLuria-Bertani）培养基）培养基3 LALALALA.3 基本培养基（基本培养基（MMMMMMMM）.3 R5R5R5R5（1L1L1L1L）链霉菌链霉菌原生质体原生质体转化时用转化时用.4 YEME(YEME(YEME(YEME(酵母膏酵母膏- - - -麦芽膏培养基麦芽膏培

2、养基) ) ) ) 1L1L1L1L（液体培养链霉菌）（液体培养链霉菌）.4 TSBYTSBYTSBYTSBY （1L1L1L1L） （液体（液体培养培养链霉菌）链霉菌）4 MSMSMSMS 培养基培养基5 2CMY2CMY2CMY2CMY 培养基（用于井岗的接合转移）培养基（用于井岗的接合转移） 5 YMSYMSYMSYMS 培养基培养基（阿维阿维，井岗产孢井岗产孢）.5 YDYDYDYD 培养基培养基5 生长因子补充物的使用浓度生长因子补充物的使用浓度.5 第二章第二章 DNADNADNADNA 基本操作基本操作7 7 7 7 大肠杆菌质粒的抽提大肠杆菌质粒的抽提.7 酶连反应酶连反应.7

3、 DNADNADNADNA 片段凝胶回收片段凝胶回收.7 DNADNADNADNA 纯化纯化.9 E.coilE.coilE.coilE.coil 总总 DNADNADNADNA 的提取的提取. 9 链霉菌质粒链霉菌质粒 DNADNADNADNA 的小量提取（还需改进）的小量提取（还需改进）10 去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及 TakaraTakaraTakaraTakara 的的 CIAPCIAPCIAPCIAP 使用说明）使用说明）.10 ATATATAT 克隆（详见说明书）克隆（详见说明书）.10 SouthernSouthernSouthe

4、rnSouthernBlotBlotBlotBlot11 第三章第三章 PCRPCRPCRPCR 及相关技术及相关技术 13131313 PCRPCRPCRPCR.13 PCRPCRPCRPCR 重组（详见重组（详见PCRPCRPCRPCR 技术实验指南技术实验指南p429p429p429p429 重叠延伸技术）重叠延伸技术） 14 PCRPCRPCRPCR 定点定点诱变（诱变（DpnIDpnIDpnIDpnI 法）法）14 第四章第四章 基因片段转移技术基因片段转移技术15151515 大肠杆菌大肠杆菌 CaClCaClCaClCaCl2 2 2 2法制备感受态细胞及法制备感受态细胞及 DN

5、ADNADNADNA 转化转化 15 DNADNADNADNA 转化转化.15 大肠杆菌质粒的快速检测大肠杆菌质粒的快速检测.15 接合转移（详见英文手册接合转移（详见英文手册249249249249 页）页）16 链霉菌原生质体的制备链霉菌原生质体的制备.16 链霉菌原生质体的转化链霉菌原生质体的转化.17 PCR-TargetingPCR-TargetingPCR-TargetingPCR-Targeting 技术中技术中 E.coliE.coliE.coliE.coli 电转化感受态的制备及电转化电转化感受态的制备及电转化17 第五章第五章 RNARNARNARNA 操作技术操作技术19

6、191919 链霉菌总链霉菌总 RNARNARNARNA 的抽提的抽提19 2 链霉菌的链霉菌的 RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR（promegapromegapromegapromega RTRTRTRTkitkitkitkit） 19 第六章第六章 蛋白质基本操作技术蛋白质基本操作技术21212121 SDS-SDS-SDS-SDS-PAGEPAGEPAGEPAGE，考马斯亮蓝染色，考马斯亮蓝染色. 21 大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由 IPTGIPTGIPTGIPTG 诱导的表达体系诱导的表达体系） ：.21 链霉菌总蛋白抽提：链

7、霉菌总蛋白抽提：.22 大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测 （含含 T7T7T7T7 表达系统如表达系统如 BL21BL21BL21BL21 菌株中的菌株中的 pETpETpETpET 系列表系列表 达体系达体系） ：.22 WesternWesternWesternWestern BlotBlotBlotBlot 23 第七章第七章 遗传作图相关技术遗传作图相关技术25252525 链霉菌孢子悬液的制备链霉菌孢子悬液的制备.25 链霉菌中链霉菌中 NFNFNFNF 的证明的证明. 25 孢子杂交孢子杂交.25 在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因在遗传图

8、谱上两个标记基因之间定位新的基因.25 第八章第八章 其他技术其他技术27272727 链霉菌菌种保藏链霉菌菌种保藏.27 检测链霉菌淀粉酶的活性检测链霉菌淀粉酶的活性.27 3 第一章第一章培养基培养基 抗生素抗生素 生长因子生长因子 常用抗生素及其使用浓度常用抗生素及其使用浓度 抗生素英文名称及缩写抗性基因 贮藏液浓度 (mg/ml) 使用终浓度（g/ml） 链霉菌大肠杆菌 MM2CMYEMELA或LB 氨苄青霉素 氯霉素 潮霉素 卡那霉素 壮观霉素 链霉素 硫链丝菌素 红霉素 阿泊拉霉素 Ampicillin, Amp Chloramphenicol, Cml Hygromycin, H

9、yg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin,Am bla cat hyg aac 或 aph aadA str tsr ermE aac(3)IV 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO 配) 100 50 R 10 10 2? 50 10 5 100 10 R 25 50 50 25 10 50 R 50 2.5 50 50-100 25 50 50 50 25 不敏感 20 30-50 * 表示无记录或不能使

10、用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制 *此表仅供参考！ ！ ！ *R 表示不敏感 *Km 和 Am 有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。 *Hyg 易见光分解，应用锡箔纸包好。 *有些抗生素需要在低盐的环境（如 DNA 培养基）下筛选效率较高，如 Hyg, Km, Vio LBLB（L Luria-Bertaniuria-Bertani）培养基）培养基 胰蛋白胨 10g， 酵母抽提物 5g， NaCl 5g，葡萄糖 1g， 蒸馏水加至 1000ml， pH7.3 左右（灭菌后第一次用时还要调一次） LALA LB 中加入终浓度为 1.5-2%的琼脂粉(不同

11、的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需 1.5%，而华美的需要 2%)。 做蓝白斑筛选时不加葡萄糖 基本培养基（基本培养基（MMMM） 溶液：L-天冬酰胺 0.5g， K2HPO40.5g, MgSO47H2O0.2g, FeSO47H2O0.01g, 4 蒸馏水至 1000ml 将每 250ml 溶液分装到装有 2.5g 琼脂的 500ml 三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入 50 葡萄糖（8 磅灭菌）5ml，调 pH7.0。 配置 MM 的琼脂有 lab agar、Ice agar(IA) R5R5（1L1L）链霉菌链霉菌原生质体原生质体转化时用转化时用 蔗糖103g K2SO40.25g MgC

12、l26H2O10.12g 葡萄糖10g Difco 酪蛋白氨基酸0.1g 微量元素溶液2ml Oxoid 酵母提取物5g TES5.73g 加蒸馏水至1000ml 称取 5.5g Difco 琼脂放入 500ml 三角瓶中，倒入 250ml 上述溶液，然后塞上塞子后 8 磅灭菌 （114 度 15 分种） 。使用时，将培养基融化，每瓶中加入： KH2PO4(0.5%)2.5ml CaCl22H2O(5M)1ml L-脯氨酸(20%)3.75ml NaOH(1M)调 pH 至 7.3 对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考手册 ） YEME(YEME(酵母膏酵母膏- -麦芽膏培养基麦芽膏培养

13、基) ) 1L1L（液体培养链霉菌）（液体培养链霉菌） Oxoid 酵母提取物3g Oxoid 蛋白胨 Tryptone5g 麦芽提取物（BD 公司原 Difco 公司 218630）3g 葡萄糖10g 蔗糖 340g 蒸馏水至 1000ml 高压灭菌后加入： （8 磅灭菌，113114 C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西， 否 则会灭不彻底。 ） MgCl26H2O(2.5M)2ml/L 制备原生质体时，还要加入： 甘氨酸（20%）25ml/L 蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。 甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源 DNA 的导入。

14、 TSBYTSBY （1L1L） （液体（液体培养培养链霉菌）链霉菌） Oxoid 胰胨豆汤粉（TSB）30g 蔗糖340g Oxoid 酵母抽提物5g 5 蒸馏水至 1000ml *不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。 MSMS 培养基培养基 将黄豆饼粉加蒸馏水煮 2 到 3 小时， 用纱布过滤得到滤液， 将每 250ml 滤液分装到装有 5g 琼脂，5g 甘露醇的 500ml 三角瓶中，10 磅灭菌，使用时调 pH7.2-7.3。 2CMY2CMY 培养基（用于井岗的接合转移）培养基（用于井岗的接合转移） 可溶性淀粉10g 胰蛋白胨2g NaCl1g

15、(NH4)2SO42g K2HPO41g CaCO32g 无机盐溶液*1 ml 琼脂20g 蒸镏水1000 ml PH7.2 无机盐溶液(每升) FeSO4.7H2O1g MgCl.6 H2O1g ZnSO4.7H2O1g YMSYMS 培养基培养基（阿维阿维，井岗产孢井岗产孢） 酵母抽提物4g 可溶性淀粉4g 麦芽糖10g CoCl. .6 H2O5mg 琼脂20g 蒸镏水1000 ml PH7.2 YDYD 培养基培养基 酵母抽提物4g 麦芽糖10g 葡萄糖4g MgCl2g CaCl1.5g 琼脂15g 蒸镏水1000 ml PH7.2 6 生长因子补充物的使用浓度生长因子补充物的使用浓

16、度 天蓝色链霉菌 1258 、J1501 等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基 中补加营养因子，使用浓度如表 生长因子补充物的使用浓度表 化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（g/ml） 组氨酸（Histidine）1050 其它氨基酸 2 7.537 腺嘌呤，鸟嘌呤， 胸腺嘧啶，尿嘧啶 1.57.5 维生素0.10.5 1.储存液用无菌去离子水配置，8 磅灭菌后 4oC 保存。 2.对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。 7 第二章第二章 DNADNADNADNA 基本操作基本操作 大肠杆菌质粒的抽提大肠杆菌质粒的抽提 苯酚苯酚/ /氯仿溶液抽提法氯仿溶液抽提法 1.接种 5ml LB，37摇床过夜培养（12 小时） 2.离心，3000rpm，5min 去上清 3.振荡混匀沉淀，分装在 2 个离心管中，spin 一下，吸去上清，加入 150l 的溶液 I （50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris Cl(PH8.0)