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1、1绿色荧光标记 C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测作者：陈腾祥，夏高晓，陈丽，刘亚伟，刘靖华，姜勇【摘要】目的：表达纯化重组的 His-EGFP-CRP 蛋白，通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法:用 pET14b/EGFP-hCRP 原核表达质粒转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析，获得复性的 His-EGFP-CRP 蛋白；并用高效毛细管电泳（HPCE）技术对复性的蛋白进行检测，了解蛋白质的等电点及活性。结果:转化实验发现，该质粒 pET14b/EGFP-hCRP 在 BL21（DE3）中能够被诱导表达；通过包涵体变性
2、溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的 His-EGFP-CRP 蛋白；HPCE 分离发现复性后的His-EGFP-CRP 蛋白峰为多个，其在电泳液 pH 值低于 6 时易检出，His-EGFP-CRP与 THP-1 细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论:成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组蛋白 His-EGFP-CRP，通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白，复性后的 His-EGFP-CRP 等电点接近于 6，以单体或多聚体等结构形式存在，具有结合活性，能与细胞内相关分子结合成复合物，可应用于 CRP 功能和内化机制的研究。【关键词】C 反应蛋白；基因表达；蛋白质复性；电泳，
3、毛细管AbstractObjective:Toexpressthepurifiedrecombinantprotein,His-EGFP-CRP,andtoevaluatethefeasibilityofitsapplicationintheresearchoffunctionandinternalizationmechanismofhumanC-reactiveprotein（CRP）.Methods:There-constructedvectorpET14b/EGFP-hCRPwastransformedintoEscherichia.coliBL21（DE3）,inducedbyisop
4、ropyl-D-thiogalactopyranoside（IPTG）.Theexpressedprotein,His-EGFP-CRP,waspurifiedwithaffinitychromatographymethodandrefoldedwithgradientfiltration.TherenaturedHis-EGFP-CRPwasanalyzedwithhighperformancecapillaryelectrophoresis（HPCE）toevaluateitsisoelectricpoint（pI）andbio-activity.Results:Fusionprotein
5、His-EGFP-CRPsuccessfullyexpressedintransformedE.colicellsaftertheinduction,andthenwaspurifiedwithinclusionlysisandaffinitychromatography.His-EGFP-CRPwasdetectedatseveralpeaksofthefractionprofileofHPCEwhenthepHofelectrophoresisbufferwasunder6.ThenumberofHis-EGFP-CRPdetectionpeaksincreasedaftertheprot
6、einwasincubatedwithlysateofTHP-1cells.Conclusions:ThepIofHis-EGFP-CRPisabout6,anditsstructuresmaybemonomerorpolymer,whichhavetheabilitytobindrelativemoleclesinlysateofTHP-1toformcomplex.Theseresultssuggesttherecombinantproteincouldbeusedinex2ploitingthefunctionandinternalizationmechanismofhumanCRP.K
7、eywordsC-reactiveprotein;geneexpression;proteinrenaturation;electrophoresis,capillaryC-反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）是一种发现较早的蛋白质，在急性心肌梗塞、创伤、感染、炎症、外科手术和肿瘤侵润时，其血浆浓度急剧升高，达到正常水平的数百倍，乃至数千倍，可以作为上述疾病的临床监测指标，是急性期蛋白的主要成员之一1 。CRP 在免疫反应过程中能识别病原体和宿主受损细胞，介导补体系统和吞噬细胞将它们清除，发挥免疫调理功能2 。除此之外，近些年来研究表明 CRP 的功能十分复杂，发现其能通过胞
8、膜进入培养的主动脉内皮细胞，从而参与粥样动脉硬化症等心血管疾病的发生35 。然而，对于CRP 内化进入细胞的行为和机制还缺乏深入的研究，原因之一是纯化原核表达的CRP 有较大难度，不易获得有体外活性的重组表达物。为解决这一技术难题，构建了带 his 纯化标签和 EGFP 荧光标记的人 CRP 原核表达质粒4 。在此工作基础上，对该融合蛋白的表达纯化和复性进行了探索，并利用高效毛细管电泳（highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE）技术对复性后的重组蛋白进行检测分析，以进一步了解该重组蛋白的基本理化特点，检测该蛋白的活性。1 材料和方法1.1 材料台
9、式低温高速离心机、台式冷冻离心机和 PA800 毛细管电泳仪（BeckmanCoulter 公司） ；MiniVE 垂直电泳系统（GEHealthcare 公司） ；原核表达质粒 pET14b/MCS-EGFP 及 pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重点实验室郭爱华和陈腾祥构建） ；大肠杆菌菌株 DH5（本室保存） ；质粒纯化试剂盒（U-Gene 公司） ；异丙基-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）由 Calbiochem 公司生产；microconYM-10 超滤浓缩装置（Millipore 公司） ；T
10、ALONMetalAffinityResin（BDBioscienceClontech 公司） ；透析袋（Merck 公司）；人单核细胞系 THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠） ；无内毒素的 RPMI-1640 培养液和胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）由 Hyclone 公司生产；proteaseinhibitorcocktail（sigma 公司） 。1.2 方法1.2.1 质粒 pET14b/MCS-EGFP 和 pET14b/EGFP-hCRP 的原核表达用 pET14b/MCS-EGFP 及 pET14b/EGFP-hCRP 分别转化 BL21（DE3）大肠杆
11、菌菌株，各挑取 3 个克隆到 5mlLB 培养液（Amp+）中，37振荡扩增，当菌液 OD值约为 0.4 时，加入 5l100mmol/LIPTG 到 5ml 的菌液中，室温振荡 4h，取 1ml菌液 3000r/min 离心 5min，加入 200l1 倍 SDS 上样缓冲液重悬沉淀，进行3SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1ml 加入到 200mlLB 培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。1.2.2His-EGFP 蛋白的纯化按 TALONMetalAffinityResin 试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液
12、。200ml 转化了质粒 pET14b/MCS-EGFP 的大肠杆菌经室温诱导 4h后，48000r/min 离心菌液 10min，用 4ml 冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，412000r/min 离心 20min，取上清加入到装有TALONMetalAffinityResin 的纯化柱中，按操作说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用 Bradford 方法定量。1.2.3His-EGFP-CRP 蛋白的纯化配制缓冲液 A（50mmol/LTris-HCl、0.5mmol/LEDTA、50mmol/LNaCl、5甘油、0.5mmol/LDTT，pH7.9） 。200ml 转化了
13、质粒 pET14b/MCS-EGFP-CRP 的大肠杆菌经室温诱导 4h 后，48000r/min 离心菌液 10min，用 10ml 含 5TritonX-100 缓冲液 A 重悬沉淀，超声波裂解细菌，412000r/min 离心 20min。沉淀（主要为包涵体和细菌碎片）转入 5ml 的玻璃匀浆器内，加入 10ml 含5TritonX-100 的缓冲液 A 充分匀浆沉淀，室温静置 20min，匀浆液离心后取沉淀重复匀浆洗涤 1 次。加入 10ml 含 3十二烷基肌氨酸钠（SKL）和 0.3十二烷基硫酸钠（SDS）的 bufferA，充分重悬沉淀，静置 60min 以缓慢溶解包涵体。溶解产物
14、 412000r/min 离心 20min，取上清加入到 microconYM-10 中，超滤浓缩到原体积的 1/2。然后加入到 TALONMetalAffinityResin 的纯化柱中，进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用 Bradford 方法定量。1.2.4SDS-PAGE 检测质粒原核表达和蛋白纯化情况分别取少量未转化质粒的 BL21（DE3） 、诱导表达的转化子、转化子菌液裂解后的离心沉淀物及上清、亲和纯化的洗脱液，加入 SDS 上样缓冲液，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达和纯化情况。1.2.5 蛋白质重折叠复性及缓冲液置换上述亲和纯化得到的 His-EGFP 和
15、 His-EGFP-CRP 蛋白液分别加入到截留分子量为 10kD 透析袋中，放入到 500ml 含 0.5mmol/LDTT 的 BufferA 中，4透析12h，每 3h 更换透析液；将透析袋放入另一个 500ml 的透析体系（含1mmol/LGSH、0.2mmol/LGSSG 和 0.6mmol/LL-精氨酸的 PBS）中，4透析 12h，每 3h 更换透析液；最后放入 500mlPBS 溶液中，4透析 3h，重复 4 次。用0.22m 的滤膜过滤除菌，Bradford 方法定量，分装后贮存于-80。1.2.6 荧光蛋白的高效毛细管电泳检测分别取纯化后的 His-EGFP 和 His-E
16、GFP-CRP 的蛋白样品，用 PBS 将浓度稀释为 100mmol/L，按操作说明加入到毛细管电泳仪 PA800 的专用样品管内以备进样4检测；检测器选用激光诱导荧光（laserinducedfluorescence,LIF）模组，检测波长为 488nm；毛细管柱为 N-CHO 内涂层的石英毛细管，内径 50m，总长度为50.2cm，从进样端至检测窗口的长度为 40cm；采用真空抽吸进样，压力为2psi，进样时间 10s，电泳电压为 20kV，进样端设置为正极，检测端为负极。分别使用 pH 值为 7.0、6.0、5.0、4.0、3.0 的电泳缓冲液（0.1%Tween20，100mmol/L 四硼酸纳）对上述 2 种样品进行分离检测。1.2.7 细胞培养及 His-EGFP-CRP 结合活性检测THP-1 用含 10%FBS 的 RPMI-1640 在 CO2 培养箱（37，5CO2）中培养。细胞培养至 11010 个/L 时，取 5ml 细胞培养物于 251000r/m
