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1、1维药蜜膏剂蜂蜜炼蜜工艺前后 5-羟甲基糠醛的含量变化研究作者：希尔艾力吐尔逊，吐鲁洪卡地尔，斯拉甫艾白，祖里皮亚塔来提【摘要】目的探讨维吾尔药传统蜜膏剂蜂蜜炼蜜工艺前后样品 5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量变化，定量炼蜜工艺中 5-HMF 含量，从而为蜜膏剂蜂蜜炼蜜工艺前后样品 5-HMF 的含量规范化提供依据。方法采用 Waters 高效液相色谱仪测定不同时间、不同温度蜂蜜炼蜜样品;制剂中心炼蜜样品;新疆各地州制剂中心炼蜜样品;蜜膏剂炼蜜工艺自制不同时间点炼蜜等样品含量。结果温度80130及时间 090min 之间蜂蜜内 5-HMF 含量变化在15.212507.97mgkg-1 之间，制
2、剂中心炼蜜样品及各地州制剂中心炼蜜前后样品 5-HMF 含量分别在 2.4102.8mgkg-1 和 1.68154.86mgkg-1 之间，蜜膏剂炼蜜工艺制备不同时间点炼蜜前后样品 5-HMF 含量在 7.56113.19mgkg-1(R)和 4.62104.19mgkg-1(Y)之间，5-HMF 在0.00640.448g(r=0.9998，n=8)范围内 5-HMF 峰面积与进样量具有良好的线性关系，平均回收率为 99.35%(n=6)，RSD 为 1.67%。结论蜂蜜炼蜜前后，加热使 5-HMF 含量显著提高，时间的延长也使样品中 5-HMF 含量增加，不同样品测定结果认为炼蜜温度以蜂
3、蜜沸点为主，炼蜜时间为微沸 20min 以内为主，蜜膏剂炼蜜时 5-HMF 含量在 200mgkg-1 范围之内，实验结果为制定蜜膏剂炼蜜工艺及质量标准提供了一定的依据，该方法测定 5-HMF 含量具有很有代表性，操作简单、准确的优点，炼蜜工艺质量控制显著。【关键词】维药蜜膏剂;5-HMF;炼蜜工艺;HPLC维吾尔药蜜膏剂是维吾尔医药独有的一个剂型，并且应用历史长达 2500 年，制备方便，口感好，营养价值高等特点是维吾尔医药常用的剂型，蜜膏剂是方中一种或几种药物研末，过箩，用炼蜜蜜成的膏状制剂，蜂蜜是维吾尔药蜜膏剂(Majunat)的主要辅料。蜂蜜在炼蜜时加热温度和加热时间是对蜂蜜质量有关的
4、主要因素，5-羟甲基糖醛是控制蜂蜜加热温度和时间有关的主要指标。5-羟甲基糠醛(hydorxymethylfurfural，HMF)是一种蜂蜜加工过程的一个产物，新鲜蜂蜜中 5-HMF 含量很低。但在蜂蜜的热处理过程中，由于有酸类化合物的存在，蜂蜜中的糖类化合物会发生脱水反应而生成 5-HMF，进而提高蜂蜜中的 5-HMF 含量。维药蜜膏剂炼蜜方法是蜂蜜倒入瓷器或表面有油漆的容器内，微火加热，用木头勺去掉泡沫，全部泡沫过滤完后，冷却，即可应用。目前存在蜂蜜炼蜜的质量差异，同时导致炼蜜工艺的不统一、不规范，炼蜜中有害成分增加，影响维药的蜜膏剂的质量。维药蜜膏剂蜂蜜的炼蜜方法全凭操作者的经验，工艺
5、参数未有定量化的研究，没有内在质量的规定，同时与中药丸剂的炼蜜方法也有区别，至今未见维药蜜膏剂炼蜜有关的文献报道。因此，本实验采用高效液相色谱仪对不同温度、不同时间 31 个炼蜜样品，不同地区、不同人、不同维吾尔医单位 10 批样品，一个单位不同批次 10 批样品以及实验室自制样品来源进行 5-HMF 含量定量分析，2从而蜜膏剂蜂蜜炼蜜的工艺标准的规范化提供依据。1 仪器与试药1.1 仪器 Waters 高效液相色谱仪，包括检测器：Waters2996 二极管陈列检测器，泵 Waters600，Waters717plus 自动进样器;色谱柱：WatersSymmetryC18(150mm4.6
6、mm，5m)。BS110S 电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司);LS-3120 超声波发生器(美国科学系统公司);油浴锅，电子温度计。1.2 试剂样品由新疆维吾尔医药研究所维药药剂学国家三级实验室制备;蜂蜜样品天山野花蜜简称 R(批号：080510)(市售);新疆伊犁养蜂场蜂蜜简称 Y(批号：080515)(新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制剂中心提供样品);甲醇为色谱级，其它试剂均为分析纯;5-HMF 对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号111626-20040)。2 方法与结果2.1 含量测定2.1.1 色谱条件色谱柱 WatersSymmetryC18(150mm4.6mm，5m)
7、，流动相为甲醇-水(1090);检测波长：285nm;流速 1.0mlmin-1;柱温 25。理论塔板数按 5-HMF 峰计算应不低于 3500。2.1.2 对照品贮备液的制备精密称取 5-HMF 对照品 20mg，置 25ml 量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含 0.8mg 的溶液。作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液 ml 置 250ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每毫升含 3.2g)。此溶液可在温度低于 4冰箱中保存。2.1.3 供试品溶液的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60的水浴中温热，振荡，待样品全部融
8、化后搅匀，冷却至室温。精密称取 2.0g，置 25ml 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45m)滤过，即得。2.1.4 线性关系的考察精密吸取上述 5-MHF 对照品溶液(每毫升含 5-HMF3.2g)2，20，40，60，80，100，120，140l 注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(g)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得标准曲线方程为：Y=20528X+4220，r=0.9998，结果表明，在 0.00640.448g 范围内，5-MHF 峰面积与进样量具有良好的线性关系。2.1.5 精密度实验精密称取同一批蜂蜜样品(批号：080510)2.0g，按供试品制备方法制备供
9、试品溶液，取同一供试品溶液 10l，重复进样 5 次,记录 5-HMF的峰面积值,计算 RSD 为 0.84%，表明精密度良好。32.1.6 稳定性实验精密称取同一批蜂蜜样品(批号：080510)按供试品制备方法制备供试品溶液，分别在同一天的不同时间进样 5 次(每隔 2h)在上述条件下依次测定。结果表明，8h 内供试品溶液基本稳定，5-MHF 峰面积的 RSD 为2.04%。A.5-HMF 对照品 B.样品 a.5-HMF 图 1 高效液相色谱图2.1.7 重复性实验精密称取同一批供试品 6 份(批号：080510)，按供试品制备方法制备供试品溶液，各取 10l 进样，测定含量，5-HMF
10、峰面积的 RSD 为0.88%。表明重复性良好。2.1.8 加样回收率实验取供试品(批号：080510)1.0g，精密称定(n=6)，分别加入浓度为 3.2gml-1 的 5-HMF8ml，按“2.1.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液及进样 10l 测定含量，计算回收率，结果见表 1。结果表明本方法的回收率良好。表 1 加样回收率实验结果2.2 样品制备及含量测定2.2.1 蜂蜜不同温度、不同时间炼制样品的制备分别取蜂蜜 500ml，倒入瓷器容器内，置于油浴锅加热，容器内蜂蜜分别温度达到80，90，100，110，120，130时恒温，每个温度分别加热时间为10，20，30，60，90
11、min，滤去蜂蜜白沫子，过滤，装入三角烧瓶内备用，HPLC法测定 5-HMF 含量。结果见表 2。2.2.2 蜜膏剂用蜂蜜制剂中心炼蜜样品的制备新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制剂中心为我区通过 GPP 认证，并生产规模及产品品种数量最全的制剂中心，按照本中心蜜膏剂炼蜜时不同批次取炼蜜前后样品，HPLC 法测定 5-HMF 含量。结果见表 3。2.2.3 各地州制剂中心炼制样品的制备选取我区通过 GPP 认证，有一定蜜膏剂生产规模的各地州维吾尔医医院取得联系，各地区生产蜜膏剂炼蜜时取得炼蜜前后样品，HPLC 法测定 5-HMF 含量。结果见表 4。2.2.4 蜜膏剂传统炼蜜工艺制备不同时间点炼蜜样
12、品的制备取蜂蜜 5kg，置于倒入瓷器或表面代油漆的容器内，取原蜂蜜 1 号样，加热初次煮沸取 2 号样，然后每个 2min 去 1 次样，依次到 22min，备用，HPLC 法测定 5-HMF 含量。结果见表 5。表 2 蜂蜜不同温度不同时间炼蜜样品 5-HMF 含量表 3 制剂中心炼蜜样品炼蜜前后 5-HMF 含量表 4 新疆各地制剂中心炼蜜样品炼蜜前后 5-HMF 含量表 5 蜜膏剂炼蜜工艺制备不同时间点炼蜜样品 5-HMF 含量3 讨论维吾尔药蜜膏剂是维吾尔医药独有的一个剂型，并且应用历史长达 2500 年，制备方便，不需高级设备，储存方便及相对稳定，口感好，辅料蜂蜜占处方中药粉的 23
13、 倍，维吾尔医常用的剂型，维吾尔医古籍文献中蜜膏剂的用量高达 35%，炼蜜工艺是蜜膏剂制备当中关键一个工艺，虽然维吾尔药丸剂的炼蜜方法与中医药炼蜜方法相似，但蜜膏剂的炼蜜方法与丸剂炼蜜有很大的区别，丸剂练蜜方法与蜜膏剂练蜜方法的比较和探索试验得知两者之间有很大的区别，不论使用目的4或炼蜜方法都不一样。目前部分人实际操作按照蜜膏剂炼蜜方法炼蜜，说起炼蜜就说丸剂炼蜜方法，因此产生炼蜜误为与丸剂炼蜜方法类似。蜂蜜中 5-HMF中国药典2005 版部，蜂蜜标准内对 5-HMF 的含量进行了限定，在 284 和 336nm 的波长处测定吸光度，吸光度差不得大于 0.34。国家标准 GB18796-200
14、5 蜂蜜标准中对新鲜蜂蜜中 5-HMF 含量规定不超过 40mgkg-1。5-HMF 反映蜂蜜的新鲜程度、加工处理条件优劣、鉴别蜂蜜中是否掺入人工转化糖等决定蜂蜜质量的重要指标14。本研究应用高效液相色谱仪对“2.2.1”项下炼蜜样品中 5-HMF 的含量测定，通过自设定 6 个恒定温度和 5 个时间段蜂蜜加热，根据变化情况发现 3 个温度区域内 5-HMF 含量变化，温度 80100时 5-HMF 含量 10 倍左右变化(煮沸温度低线区)，变化情况逐步增高，温度 1105-HMF 含量第一时间段就 20 倍以上变化(煮沸温度中线区)，变化情况第一时间含量猛增并上升趋势，温度 1201305-
15、HMF 含量 100160 倍之间变化(煮沸温度高线区)，变化情况很大，蜂蜜颜色也为深黑色。因此结合测定 3 种蜂蜜在 6 个恒定温度和 5 个时间段加热，结果也相同，测定不同蜂蜜沸点，蜂蜜自然沸点在 106116之间，这与蜂蜜含水量与相对密度有关，含水高沸点低，通过测定及分析得知，蜂蜜自然加热煮沸温度在煮沸温度低线区和煮沸温度中线区之内，因此蜂蜜加热最佳温度在自然煮沸温度之内加热，不需要恒定温度来加热，如恒定高温，蜂蜜沸点低的蜂蜜受到的影响大，5-HMF 含量高。在本实验对不同地区、不同人、不同维吾尔医单位 10 批样品，一个单位不同批次 10 批样品以及实验室自制 2 批样品 5-HMF
16、含量定量分析， “2.2.2”项下样品炼蜜前都在合格范围之内，炼蜜后超出了国家规定的含量范围，并在43.8102.8mgkg-1 范围变化。 “2.2.3”项下样品炼蜜前除了 1 个地区样品超出范围之外其它都合格，炼蜜后超出了国家规定的含量范围，并在15.70154.86mgkg-1 范围变化。通过“2.2.4”项下样品验证了样品“2.2.2”项下和“2.2.3”项下样品 2 批(R、Y)实验结果，炼蜜前 5-HMF 含量为7.56mgkg-1 和 4.62mgkg-1，炼蜜后逐步上升到 113.19mgkg-1 和104.19mgkg-1，时间为 22min。普遍认为，5-HMF 有一定的毒副作用，但文献报道，5-HMF 近几年来研究表明其还具有抗氧化、改善血液流变学、影响甘草酸代谢促进甘草酸和次甘草酸抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇对人体有利的作用58。实验结果蜂蜜炼蜜前后，加热使 5-HMF 含量显著提高，时
