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1、1细菌多重耐药外排泵抑制剂研究进展【摘要】 细菌耐药性，尤其是多重耐药性(multidrug resistance，MDR)已经成为非常严重的医疗问题，而多种类型细菌外排泵(efflux pumps)的存在是细菌多重耐药的重要机制，因此寻找有应用前景的外排泵抑制剂(efflux pump inhibitors，EPI)是十分必要且迫切的。目前已经发现外排泵抑制剂的作用机制分为：(1)干扰外排泵组装；(2)阻断外排泵能量来源；(3)阻碍底物通过外排通道；(4)机制未知。本文按照作用机制对已经发现的细菌多重耐药外排泵抑制剂的特点进行分述。 【关键词】 细菌多重耐药性 外排泵 抑制剂Advances
2、 in the research onbacterial multidrug resistance efflux pump inhibitorsABSTRACT Bacterial resistance to antibiotics, especially the multidrug resistance (MDR) has become a serious problem of healthcare. The existence of various kinds of efflux pumps is one of the important mechanisms of bacterial r
3、esistance. It is exigent to discover the efflux pump inhibitors which could be used in clinic. So far, various kinds of efflux pump inhibitors have been discovered. Their mechanisms of action are (1) interfering the assembling of efflux pumps, (2) blocking the energy supply of efflux pumps, (3) hind
4、ering the transit of substrates through the efflux tunnel and (4) unknown mechanism. According to the mechanisms of action, the characters of bacterial multidrug resistance efflux pump inhibitors discovered by far were summarized in this review.KEY WORDS Bacterial multidrug resistance; Efflux pump;
5、Inhibitor伴随着抗生素的广泛使用，各种类型的耐药菌不断出现，抗感染治疗面临着严峻的挑战。细菌外排作用是细菌产生耐药性的重要途径。目前已经发现了 5个外排泵类型，它们是：ATP 结合盒超家族(ATPbinding cassette superfamily，ABC)，小多重耐药家族(small multidrug resistance family，SMR)，主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)，多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)和耐药节结化细胞分
6、化家族(resistance/nodulation/cell division family，RND)1 。从底物特异性上看，外排泵又分为特异性外排泵和多重耐药外排泵。前者如包括肠杆菌和铜绿假单胞菌在内的多种革兰阴性菌表达的 Tet AE ，G，H 外排泵，对四环素类抗生素有特异外排作用；后者分布更为广泛，如铜绿假单胞菌 MexABOprM 外排泵，金葡菌 NorA外排泵2等等。2多重耐药外排泵底物谱广，并且可以外排大量的结构迥异的抗生素及其他有毒物质，例如铜绿假单胞菌 MexABOprM 外排泵的外排底物有大环内酯类、喹诺酮类、四环素类、 内酰胺类抗生素以及氯霉素、林可霉素、新生霉素等等。多
7、重耐药外排泵广泛存在于各种病原菌中，对细菌的药物敏感性以及细菌性感染的临床治疗影响很大。例如过量表达 MexABOprM 外排蛋白的铜绿假单胞菌菌株比 MexABOprM 的基因敲除菌株的左氧氟沙星 MIC高 64倍3 ，临床分离的高表达 NorA外排泵的金葡菌株较野生菌株对诺氟沙星和环丙沙星 MIC分别提高了 16倍和 816 倍4 。同时，外排泵的存在降低了胞内抗生素浓度，低浓度抗生素环境中易产生耐药突变株。目前已经发现了一些具有细菌外排泵抑制活性的化合物，但目前还没有一种能够用于临床治疗，外排泵抑制剂类药物的研发工作任重而道远。本文概述了迄今发现的具有细菌多重耐药外排泵抑制活性的化合物以
8、及它们的作用特点。1 干扰外排泵组装的外排泵抑制剂Globomycin是一种链霉菌来源的环肽结构的抗生素，它是脂蛋白信号肽酶LspA的抑制剂，通过抑制 LspA从而抑制含有 LspA剪接位点的膜融合脂蛋白前体的加工。大肠埃希菌(Escherichia coli)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)组成性表达 RND型外排泵 AcrABTolC 的组件 AcrA前体含有 LspA的剪接位点，在 globomycin的作用下不能形成成熟的 AcrA，也不能和外排泵的其他组分结合形成外排泵，抑制了外排泵的作用。文献报道 75mol/L globomycin 能够使表达 Acr
9、ABTolC 的产气肠杆菌的氯霉素 MIC降低至原值的 1/4，其外排泵抑制能力与 CCCP(100mol/L)相同，低于PAN(100mol/L，MIC 降低至原值的 1/8)5 。2 阻断外排泵能量来源的外排泵抑制剂(图 1)除 ABC型外排泵是依赖 ATP水解驱动外，其余四种外排泵 SMR、MFS、MATE和 RND均由质子动力势驱动1 。对细菌多重耐药外排泵抑制剂的研究发现，以阻断外排泵能量来源为机制的外排泵抑制剂主要针对质子动力势，按照作用机制又分为解偶联剂和离子载体两种类型。这类抑制剂在抑制细菌外排泵的同时也会抑制机体正常的质子动力势驱动的生理反应，缺乏特异性，因此难以用于临床治疗
10、。2.1 解偶联剂(1)化学合成来源的抑制剂 羰基 氰 间 氯苯腙(carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone ，CCCP)。分子解离状态下，负电荷分布于分子中的多个原子，分子周围的电场很弱，可在磷脂膜两侧自由扩散，传递质子以破坏跨膜电化学梯度，因此它是很强的解偶联剂。CCCP 作为外排泵抑制剂对 SMR型外排泵(如大肠埃希菌 QacE)、MFS 型外排泵(如金葡菌 NorA)、MATE 型外排泵(如多形拟杆菌 NorM)和 RND型外排泵(如铜绿假单胞菌 MexABOprM ，大肠埃希菌3AcrAB和 AcrEF，产气肠杆菌 AcrABTolC ，空肠弯曲
11、杆菌 CmeABC)等均有抑制作用510 。例如，100mol/L 的 CCCP可以使表达 AcrABTolC 的产气肠杆菌的氯霉素 MIC降低至原值的 1/45 。(2)临床药物来源的抑制剂 兰索拉唑(lansoprazole)和奥美拉唑(omeprazole)临床上用于治疗消化性溃疡。已证明它们可以抑制金葡菌 NorA外排泵，在 100g/ml 浓度下可使 NorA高表达株的诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星 MIC降低至原值的 1/41/8，推测其机制与 CCCP相似4 。此外，兰索拉唑还可以抑制和 NorA同源的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)EmeA外排泵11 。2
12、.2 离子载体由链霉菌产生的 valinomycin和 nigericin均为钾离子载体。Valinomycin能与 K+配位结合形成脂溶性复合物，穿过质膜，将膜外 K+运送到膜内，从而破坏膜电位 。Nigericin 可以使 H+和 K+交换，破坏 pH梯度。两者均可以干扰跨膜电化学质子梯度，抑制外排泵。文献报道它们可以抑制金葡菌 QacA外排泵，在 4mol/L 浓度下使细胞内乙啡啶的积累量提高约 3倍12 ，它们还可以抑制肺炎链球菌(Streptococcus 阻断外排泵能量来源的外排泵抑制剂 pneumoniae)对氟喹诺酮类等化合物的外排泵。3 阻碍底物通过外排泵通道的外排泵抑制剂(
13、图 2)3.1 化学合成来源的此类抑制剂二胺类化合物 LPheLArgnaphthylamine(PAN ，即MC207110) 是发现最早的铜绿假单胞菌 MexABOprM 、MexCDOprJ 和MexEFOprN 等 RND型外排泵抑制剂，40g/ml 的 PAN 可将上述三种外排泵高表达株的左氧氟沙星 MIC降低至原值的 1/60，其机制是结合外排泵相应位点以阻止其他底物与该位点的结合3 。PAN 除了能抑制铜绿假单胞菌 RND型外排泵，还可抑制其他一些革兰阴性菌的 RND型外排泵，如沙门菌属 AcrAB、大肠埃希菌、产气肠杆菌 AcrABTolC 等1317 。当然，并非所有革兰阴性
14、菌的RND型外排泵都可以受到 PAN 的抑制，例如其不能抑制类鼻疽伯克菌(Burkholderia pseudomallei)的 RND型外排泵18 ，也不能抑制嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的 SmeDEF外排泵对环丙沙星和四环素的外排作用19 ，甚至还会增加铜绿假单胞菌 MexXYOprM 外排泵对氨基糖苷类药物的外排作用，其确切的作用机制有待证明20 。DOrnDhPhe3aminoquinoline(MC02595) 是另一种具有抑制铜绿假单胞菌 RND型外排泵活性的二胺类化合物，活性和 PAN 相似，在 510g/ml 均可以使左氧氟沙星
15、 MIC降低至原值的 1/8倍，但是这两种二胺类化合物对小鼠表现出明显的毒性，因此不能直接用于临床治疗21 。经过结构优化，获得了诸如 MC04124 的活性不减，毒性更小(毒性降至原值的 1/4以下)的化合物21 。对 MC04124 已经进行了小鼠急毒和大鼠药动学试验22 ，但未见后续研究报道。4某些喹啉(quinoline)衍生物对产气肠杆菌和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)临床分离株的 AcrABTolC 外排泵具有抑制活性，如某些喹啉的吡啶23 、烷氧氨基24 、烷氧基25和硫代烷氧基26衍生物。通过构效关系研究推测这类衍生物的作用机制可能是结合或者遮盖外排
16、泵中的底物结合位点，阻止底物的运输27 。目前未见关于此类化合物的临床研究报道。3.2 临床药物来源的此类抑制剂利血平(reserpine)是一种生物碱，临床上用于治疗高血压。从目前报道显示，利血平对于 MFS以及 ABC型外排泵具有抑制作用28 。Ahmed 等通过特定位点氨基酸取代推测出了利血平在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bmr外排泵上的结合位点29 ，其作用机制为竞争性抑制。已有的报道证明利血平可以抑1：二胺类(MC207110 ，MC02595 ，MC04124) ； 2：部分具活性的喹啉衍生物； 3：利血平； 4：维拉帕米图 2 阻碍底物通过外排泵通道的外排泵抑制剂制多种多重耐药外排泵，如MFS型外排泵枯草芽孢杆菌 Bmr、金葡菌 NorA、肺炎链球菌 PmrA以及 ABC型
